急性多重應(yīng)激致認(rèn)知損害的相關(guān)分子及防治研究.pdf

1、應(yīng)激（stress)是在內(nèi)外環(huán)境變化的刺激下，機(jī)體出現(xiàn)的非特異性全身反應(yīng)，包括精神、神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫等方面。應(yīng)激在生命活動(dòng)中無(wú)處不在，適度應(yīng)激有利于機(jī)體度過(guò)短期惡劣環(huán)境，保存生命，但應(yīng)激強(qiáng)度過(guò)大或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則給機(jī)體帶來(lái)?yè)p傷。應(yīng)激可引起人的認(rèn)知功能損傷。如人在應(yīng)激后能出現(xiàn)注意力、學(xué)習(xí)能力、記憶的鞏固提取能力、氣味識(shí)別能力等損傷的現(xiàn)象，這使人們?cè)谏?、工作和學(xué)習(xí)中表現(xiàn)變差，不僅降低個(gè)人生活質(zhì)量，而且給社會(huì)和個(gè)人帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但目前

2、應(yīng)激致認(rèn)知損害的機(jī)制并不明確，臨床尚無(wú)有效防治藥物，也無(wú)用于早期預(yù)警的生物標(biāo)志物，給臨床診斷及有效防治措施研究帶來(lái)巨大困難。本課題的主要目的是研究應(yīng)激致認(rèn)知損害的相關(guān)分子、生物標(biāo)志物以及尋找應(yīng)激致認(rèn)知損害的防治藥物。
　　第一部分急性多重應(yīng)激致認(rèn)知損害的相關(guān)分子研究
　　應(yīng)激可導(dǎo)致許多動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力下降以及腦組織樹(shù)突結(jié)構(gòu)損傷，這些認(rèn)知損害動(dòng)物模型為我們尋找應(yīng)激致認(rèn)知損害相關(guān)的分子及相關(guān)通路提供了可能。在本課題中我們采用急

3、性多重應(yīng)激小鼠模型，首先檢測(cè)了不同程度應(yīng)激后受試動(dòng)物血漿皮質(zhì)酮濃度、認(rèn)知行為能力和腦組織樹(shù)突以及突觸結(jié)構(gòu)的變化。進(jìn)而，我們采用PCR芯片檢測(cè)了受試動(dòng)物腦中90個(gè)可能與應(yīng)激和認(rèn)知功能有關(guān)分子的mRNA表達(dá)變化，并將差異表達(dá)的分子與應(yīng)激所引起的樹(shù)突結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行相關(guān)性分析，找出與樹(shù)突結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)的分子。然后采用網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)的研究手段，以這些分子為種子構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析這些分子的相互作用關(guān)系，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)中所涉及的分子用功能富集分

4、析的方法尋找它們所涉及的通路和生理途徑，為進(jìn)一步揭示應(yīng)激致認(rèn)知損害的分子機(jī)制以及干預(yù)的靶點(diǎn)和措施研究提供線索。另一方面，我們還同時(shí)檢測(cè)了不同應(yīng)激程度下外周血有核細(xì)胞中上述90個(gè)可能與應(yīng)激和認(rèn)知功能有關(guān)分子的mRNA表達(dá)變化情況，旨在尋找能反應(yīng)應(yīng)激程度的生物標(biāo)志物，從而為尋找應(yīng)激致認(rèn)知損害的生物標(biāo)志物提供線索。
　　1.不同程度急性多重應(yīng)激模型的制備及其對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　為模擬現(xiàn)實(shí)中突發(fā)的急性復(fù)雜的應(yīng)激因素，采用BAL

5、B/c小鼠，同時(shí)給予束縛、強(qiáng)光、振蕩、噪音和禁水、禁食等刺激，共5hr，制備急性多重應(yīng)激動(dòng)物模型。其中，根據(jù)光強(qiáng)（67、200或600Lux）、振蕩速度(77、130或220rpm)及噪音強(qiáng)度（83、100或120dB）參數(shù)的不同將應(yīng)激分為輕、中和重度三個(gè)應(yīng)激程度，檢測(cè)三種條件下模型動(dòng)物血漿皮質(zhì)酮水平及學(xué)習(xí)記憶能力的變化。結(jié)果如下：
　　1.1不同程度急性多重應(yīng)激條件下血漿皮質(zhì)酮水平的變化
　　為檢測(cè)不同程度急性多重應(yīng)激條件

6、下受試小鼠血漿皮質(zhì)酮水平的變化，在應(yīng)激開(kāi)始后30、60、90和120min以及應(yīng)激結(jié)束后4、8和16min，我們對(duì)受試動(dòng)物采血，取血漿，并用 ELISA的方法檢測(cè)了它們血漿皮質(zhì)酮的含量。結(jié)果顯示，無(wú)論是在應(yīng)激開(kāi)始過(guò)程中還是結(jié)束后均檢測(cè)到三個(gè)應(yīng)激組的血漿皮質(zhì)酮濃度均明顯高于對(duì)照組，但三者之間無(wú)明顯區(qū)別。結(jié)果提示，應(yīng)激可引起血漿皮質(zhì)酮濃度升高，但其濃度變化幅度與應(yīng)激程度的大小無(wú)明顯關(guān)系。
　　1.2不同程度急性多重應(yīng)激對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響

7、
　　1.2.1被動(dòng)回避反應(yīng)能力
　　給予BALB/c小鼠三種程度的急性多重應(yīng)激后，經(jīng)90min的情緒恢復(fù)，采用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)動(dòng)物被動(dòng)回避反應(yīng)能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激后成功小鼠的百分率和潛伏期出現(xiàn)程度依賴性地下降，如對(duì)照組、輕度應(yīng)激組、中度應(yīng)激組和重度應(yīng)激組的成功小鼠的百分率分別為75.00％、62.50%、37.50%和14.29%，潛伏期分別為145.63、120.76、96.24和63.91s，其中重度應(yīng)激組的潛伏期與對(duì)

8、照組相比明顯下降（P＜0.05）。而應(yīng)激后的錯(cuò)誤次數(shù)出現(xiàn)程度依賴性地升高，如對(duì)照組、輕度應(yīng)激組、中度應(yīng)激組和重度應(yīng)激組的錯(cuò)誤次數(shù)分別為0.250、0.500、0.880和0.857，其中重度應(yīng)激組的錯(cuò)誤次數(shù)與對(duì)照組相比差異明顯（P＜0.05）。這些結(jié)果顯示，急性多重應(yīng)激可導(dǎo)致跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中成功小鼠百分率顯著減小，潛伏期顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多，且隨應(yīng)激程度的加重，上述指標(biāo)的變化逐漸加劇，說(shuō)明急性多重應(yīng)激可以程度依賴性地導(dǎo)致小鼠被動(dòng)回避反應(yīng)

9、能力明顯降低。
　　1.2.2物體識(shí)別記憶能力
　　BALB/c小鼠首先進(jìn)行新異物體識(shí)別相關(guān)環(huán)境適應(yīng)，共進(jìn)行2d，每天2hr，并在第3天接受三種程度的急性多重應(yīng)激。應(yīng)激結(jié)束后經(jīng)90min的情緒恢復(fù)，采用新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)物體識(shí)別記憶能力。結(jié)果顯示，在應(yīng)激后的學(xué)習(xí)期，對(duì)照組和各應(yīng)激組對(duì)A和B兩個(gè)相同物體的探索時(shí)間無(wú)差異。在學(xué)習(xí)期后2hr的測(cè)試階段，以新物體C替換舊物體B，以觀察動(dòng)物對(duì)新舊物體識(shí)別能力的差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照

10、組及輕度應(yīng)激組動(dòng)物探索新物體C的時(shí)間明顯長(zhǎng)于探索舊物體 A的時(shí)間，即對(duì)新、舊兩物體探索時(shí)間有明顯差別，說(shuō)明動(dòng)物仍具有對(duì)新異物體感興趣的特性；而中度應(yīng)激組和重度應(yīng)激組動(dòng)物對(duì)新、舊兩物體的探索時(shí)間無(wú)明顯差別，說(shuō)明應(yīng)激明顯損害了動(dòng)物對(duì)新異物體感興趣的特性。上述結(jié)果提示中度或重度急性多重應(yīng)激損傷了受試動(dòng)物的物體識(shí)別記憶能力。
　　2.不同程度急性多重應(yīng)激對(duì)腦內(nèi)樹(shù)突和突觸結(jié)構(gòu)的影響
　　為觀察急性多重應(yīng)激對(duì)BALB/c小鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)

11、腦區(qū)樹(shù)突和突觸結(jié)構(gòu)的影響，在給予受試小鼠輕、中和重度應(yīng)激后30 min，取一半腦用于高爾基染色觀察腦組織樹(shù)突結(jié)構(gòu)和透射電子顯微鏡觀察腦組織突觸超微結(jié)構(gòu)（另一半腦用于分子檢測(cè)），并對(duì)整個(gè)半腦腦區(qū)及海馬和皮層高爾基染色顯示的樹(shù)突長(zhǎng)度、分支數(shù)目和樹(shù)突棘密度等進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，急性多重應(yīng)激對(duì)整個(gè)半腦腦區(qū)、海馬和皮層的神經(jīng)元數(shù)目均無(wú)明顯影響，但卻顯著損傷了海馬和皮層的樹(shù)突和突觸結(jié)構(gòu)。
　　2.1不同程度急性多重應(yīng)激損傷了樹(shù)突結(jié)構(gòu)

12、>　　大腦皮層以及其各功能分區(qū)包括視皮層、聽(tīng)覺(jué)皮層和嗅皮層的樹(shù)突長(zhǎng)度、分支數(shù)目和樹(shù)突棘密度測(cè)量結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，重度應(yīng)激組的整個(gè)大腦皮層的樹(shù)突棘密度明顯降低，中度和重度應(yīng)激組視皮層樹(shù)突長(zhǎng)度明顯縮短，而輕度應(yīng)激組聽(tīng)覺(jué)皮層樹(shù)突分支數(shù)目明顯增加。不同應(yīng)激程度組比較的結(jié)果顯示，重度應(yīng)激組聽(tīng)覺(jué)皮層樹(shù)突棘密度減少程度顯著高于輕度和中度應(yīng)激組。
　　海馬以及其各分區(qū)包括齒狀回、CA1、CA2和 CA3的樹(shù)突長(zhǎng)度、分支數(shù)目和樹(shù)突棘密度測(cè)定的

13、結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各種程度的應(yīng)激均降低了海馬和海馬 CA1區(qū)的樹(shù)突棘密度；輕度應(yīng)激降低了海馬CA1的樹(shù)突長(zhǎng)度；重度應(yīng)激使海馬CA3區(qū)的樹(shù)突分支數(shù)目減少。
　　上述結(jié)果顯示，急性多重應(yīng)激對(duì)海馬和皮層的樹(shù)突結(jié)構(gòu)均有一定程度的損傷，且隨著應(yīng)激程度的增加損傷加重。
　　2.2不同程度急性多重應(yīng)激損傷了突觸結(jié)構(gòu)
　　采用透射電子顯微鏡觀察了不同程度的急性多重應(yīng)激對(duì)大腦皮層及海馬突觸結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性多重應(yīng)激降低了突

14、觸囊泡的數(shù)目、增加了突觸間隙、降低了突觸的曲率并減少了突觸后膜致密質(zhì)的厚度。其中重度應(yīng)激組與對(duì)照組相比對(duì)突觸囊泡的數(shù)目以及突觸的曲率降低最明顯，這些結(jié)果顯示，急性多重應(yīng)激程度依賴性地?fù)p傷了海馬的突觸結(jié)構(gòu)。
　　3.急性多重應(yīng)激致樹(shù)突結(jié)構(gòu)變化相關(guān)的分子
　　3.1急性多重應(yīng)激所致差異表達(dá)分子
　　為探索急性應(yīng)激對(duì)受試小鼠海馬、皮層和外周血中與應(yīng)激和認(rèn)知有關(guān)的基因表達(dá)情況，采用 PCR芯片的方法檢測(cè)了有文獻(xiàn)報(bào)道的90個(gè)可能

15、與應(yīng)激和認(rèn)知功能有關(guān)分子mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　在皮層中，應(yīng)激組APBB1、CLSTN1、KCNA4、NOTCH3、PLAU、RPS6KA1、SYP和TGFB1的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比明顯下調(diào)，而KCNA1明顯上調(diào)；而在海馬中，應(yīng)激組KCNA4、NOTCH3、NTRK3和SNCA的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。
　　在外周血中，應(yīng)激組BACE1的表達(dá)明顯下調(diào)，F(xiàn)OS的表達(dá)明顯上調(diào)，二者均與應(yīng)激程度密切相關(guān)，隨著應(yīng)激程度

16、的增加，BACE1下調(diào)程度逐漸增加，而FOS上調(diào)程度逐漸增加。該結(jié)果提示，BACE1和FOS表達(dá)變化的程度與應(yīng)激程度密切相關(guān)，有可能與認(rèn)知功能損傷程度密切相關(guān)，有作為應(yīng)激程度指示劑或認(rèn)知損傷標(biāo)志物進(jìn)行深入研究的必要。
　　3.2差異表達(dá)變化分子與樹(shù)突結(jié)構(gòu)以及各部位間差異表達(dá)變化分子的相關(guān)性分析
　　為探索差異表達(dá)分子與樹(shù)突結(jié)構(gòu)變化之間的相關(guān)性以及各部位（海馬、皮層和外周血）間差異表達(dá)分子間的相關(guān)性，我們用Pearson相關(guān)性

17、分析的方法來(lái)分析海馬和皮層中樹(shù)突結(jié)構(gòu)（樹(shù)突長(zhǎng)度、樹(shù)突分支數(shù)目和樹(shù)突棘的密度）改變與差異表達(dá)分子之間的相關(guān)性，以及它們?cè)诤ｑR、皮層和外周血中表達(dá)變化的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在皮層中，應(yīng)激所引起的基因CLSTN1、PLAU和NOTCH3的表達(dá)變化與聽(tīng)覺(jué)皮層樹(shù)突分支的數(shù)目變化呈負(fù)相關(guān)；而TGFB1的表達(dá)變化與視覺(jué)皮層中樹(shù)突棘的數(shù)目變化呈正比。在海馬中， NOTCH3的表達(dá)變化與其CA3區(qū)樹(shù)突的分支數(shù)目變化呈正比。這些結(jié)果提示，CLSTN1、PLA

18、U、NOTCH3和TGFB1可能是應(yīng)激致認(rèn)知損害相關(guān)的重要分子。另外發(fā)現(xiàn)，皮層和外周血中BACE1基因表達(dá)變化具有正相關(guān)關(guān)系，提示外周血中BACE1的變化情況可以提示其在腦中的變化，有作為認(rèn)知損傷標(biāo)志物進(jìn)行深入研究的必要。
　　3.3急性多重應(yīng)激所致樹(shù)突結(jié)構(gòu)損傷相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)
　　為了找出應(yīng)激致樹(shù)突結(jié)構(gòu)損傷的分子網(wǎng)絡(luò)，我們用與樹(shù)突結(jié)構(gòu)變化具有相關(guān)性的四個(gè)差異表達(dá)變化基因CLSTN1、PLAU、NOTCH3和TGFB1作為種子構(gòu)

19、建應(yīng)激致樹(shù)突結(jié)構(gòu)損傷的相關(guān)分子的PPI網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，我們得到了一個(gè)具有59個(gè)節(jié)點(diǎn)、136個(gè)邊，網(wǎng)絡(luò)直徑為6的急性應(yīng)激致樹(shù)突結(jié)構(gòu)損傷的PPI網(wǎng)絡(luò)。其中，TGFB1、PLAU、NOTCH3和CLSTN1度數(shù)（degree）分別為28、12、9和6，處于網(wǎng)絡(luò)的核心位置。綜合實(shí)驗(yàn)和網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果提示，TGFB1、PLAU、NOTCH3和CLSTN1可能是急性多重應(yīng)激致樹(shù)突結(jié)構(gòu)損傷的關(guān)鍵分子。
　　進(jìn)而，我們采用DAVID平臺(tái)上的GO功能

20、注釋和KEGG通路富集的方法分別對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的分子進(jìn)行功能分析，GO功能注釋結(jié)果顯示，跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路（transmembrane receptor protein serine/threonine kinase signaling pathway）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（TGF-beta receptor signaling pathway）、 Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路（notch signalin

21、g pathway）排列在前三位。KEGG通路富集的方法所得到的前三位通路分別為：Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路（notch signaling pathway）、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)（complement and coagulation cascades）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（TGF-beta signaling pathway）。兩個(gè)方法的結(jié)果提示Notch和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與急性多重應(yīng)激引起樹(shù)突結(jié)構(gòu)損傷關(guān)系最為密切，進(jìn)

22、而提示急性多重應(yīng)激引起樹(shù)突結(jié)構(gòu)損傷且最終導(dǎo)致認(rèn)知損害的最可能的通路是Notch和TGF-beta信號(hào)通路。
　　第二部分 LW-AFC對(duì)急性多重應(yīng)激致認(rèn)知損害的防治作用研究
　　應(yīng)激致認(rèn)知損害是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，目前國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為，應(yīng)激致認(rèn)知損害可能涉及到 NIM網(wǎng)絡(luò)失衡、神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、神經(jīng)生長(zhǎng)障礙以及氧化應(yīng)激等多個(gè)生物過(guò)程的異常。而我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激致樹(shù)突結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)而引起認(rèn)知損害的原因是通過(guò)擾動(dòng)了一個(gè)由多個(gè)與樹(shù)突結(jié)

23、構(gòu)相關(guān)的分子組成的分子相互作用網(wǎng)絡(luò)引起的。故本研究認(rèn)為，能夠防治應(yīng)激致認(rèn)知損害的藥物需有調(diào)節(jié)多個(gè)生物過(guò)程的功能。我國(guó)傳統(tǒng)的中藥大多有這樣的特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外已研究發(fā)現(xiàn)許多對(duì)應(yīng)激所導(dǎo)致的認(rèn)知損害具有明顯的預(yù)防和治療作用的藥物幾乎均為中藥或其提取物，如狹葉柴胡（Bupleurum falcatum, BF）的提取液、甘草提取液、四逆散和ω-3脂肪酸等。這些中藥主要是通過(guò)調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)以及神經(jīng)保護(hù)作用從而緩解應(yīng)激所造成的神經(jīng)系

24、統(tǒng)功能損傷。
　　六味地黃湯（ Liuwei Dihuang Decoction, LW）是中醫(yī)滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典名方，我室多年研究結(jié)果表明調(diào)節(jié)NIM網(wǎng)絡(luò)是其主要作用機(jī)制。LW-AFC是由LW活性成分群組成的新復(fù)方，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，LW及LW-AFC對(duì)多種慢性應(yīng)激所致的NIM網(wǎng)絡(luò)紊亂具有明顯改善作用，對(duì)快速老化模型小鼠SAMP8和轉(zhuǎn)基因小鼠APP/PS1表現(xiàn)出的認(rèn)知功能障礙具有明顯改善作用。本研究的目的在于考察LW-AFC能否改

25、善急性多重應(yīng)激所造成的認(rèn)知功能損傷以及其可能的作用途徑或機(jī)制。
　　在本研究我們采用對(duì)應(yīng)激敏感的BALB/c小鼠作為受試對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為6組，分別為對(duì)照組、應(yīng)激組、陽(yáng)性藥組、LW-AFC低、中、高三個(gè)劑量組。在急性多重應(yīng)激前2周每天灌胃給予低、中、高三個(gè)劑量的LW-AFC至應(yīng)激前30min。而只在應(yīng)激當(dāng)天的應(yīng)激前30min灌胃給予陽(yáng)性藥美替拉酮（可針對(duì)性地降低應(yīng)激引起的皮質(zhì)酮升高）。給藥完成后應(yīng)激組、陽(yáng)性藥組、LW-AFC低、中、高

26、三個(gè)劑量組給予同時(shí)束縛、強(qiáng)光（600Lux）、振蕩（220rpm）、噪音（120dB）和禁水、禁食等刺激，共5hr。檢測(cè)各組受試小鼠被動(dòng)回避反應(yīng)能力以及皮層中90個(gè)與應(yīng)激和認(rèn)知功能相關(guān)的分子的表達(dá)變化。結(jié)果如下：
　　1. LW-AFC對(duì)急性多重應(yīng)激致被動(dòng)回避反應(yīng)能力的損傷具有改善作用
　　采用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了受試小鼠的的被動(dòng)回避反應(yīng)能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激組的成功小鼠百分率明顯低于對(duì)照組，而陽(yáng)性藥和LW-AFC給藥后對(duì)應(yīng)激造成的

27、成功小鼠百分率下降現(xiàn)象均有改善作用，其中LW-AFC中劑量和高劑量效果最好。（對(duì)照組、應(yīng)激組、陽(yáng)性藥組、LW-AFC低、中、高劑量組的成功小鼠的百分率分別為60.00%、14.29%、42.86%、28.57%、62.50%和62.50%）。應(yīng)激組的潛伏期與對(duì)照組相比明顯下降，而給予陽(yáng)性藥和LW-AFC后對(duì)應(yīng)激造成的潛伏期下降現(xiàn)象均有改善作用，其中陽(yáng)性藥和LW-AFC中劑量和高劑量效果較為明顯。（對(duì)照組、應(yīng)激組、陽(yáng)性藥組、LW-AFC低

28、、中、高劑量組的潛伏期分別為148.69、46.48、138.93、85.19、148.11和136.62s）。另外，應(yīng)激組的錯(cuò)誤次數(shù)明顯高于對(duì)照組，而陽(yáng)性藥、LW-AFC中劑量和高劑量對(duì)應(yīng)激所造成的錯(cuò)誤次數(shù)升高現(xiàn)象均有改善作用，其中LW-AFC中劑量和高劑量效果最好。（對(duì)照組、應(yīng)激組、陽(yáng)性藥組、LW-AFC低、中、高劑量組的錯(cuò)誤次數(shù)分別為0.330、1.140、0.570、1.290、0.290和0.430）。結(jié)果顯示，應(yīng)激降低了成功

29、小鼠百分率，縮短了潛伏期并增加了錯(cuò)誤次數(shù)，提示應(yīng)激導(dǎo)致小鼠的被動(dòng)回避反應(yīng)能力損傷， LW-AFC劑量依賴性地增加了成功小鼠百分率，延長(zhǎng)了潛伏期并減少了錯(cuò)誤次數(shù)，其中，中劑量和高劑量LW-AFC給藥組可使它們恢復(fù)到正常狀態(tài)，提示LW-AFC預(yù)防給藥對(duì)急性多重應(yīng)激所造成被動(dòng)回避反應(yīng)能力障礙具有良好的保護(hù)作用。
　　2. LW-AFC對(duì)急性多重應(yīng)激致認(rèn)知損害作用分子機(jī)制的初步探討
　　2.1 LW-AFC對(duì)急性多重應(yīng)激引起的分子表

30、達(dá)變化的調(diào)節(jié)作用
　　跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠斷頭取腦，并分離出皮層，進(jìn)而我們用 PCR芯片的方法檢測(cè)了皮層中90個(gè)與應(yīng)激和認(rèn)知功能相關(guān)的分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激使皮層中 NEFH、NEFM、NSF、PLAU、PRKCA、STAT3、STUB1、APBB1、NTRK3、GRIA2和NOTCH3的表達(dá)下調(diào)。而給予LW-AFC后，NEFH、PLAU、STAT3和STUB1有明顯的上調(diào)的趨勢(shì)。
　　2.2 LW-AFC所調(diào)節(jié)的皮層中能夠改

31、善急性多重應(yīng)激致認(rèn)知損害的分子網(wǎng)絡(luò)特征
　　應(yīng)激致認(rèn)知損害是通過(guò)擾動(dòng)具有多個(gè)生理功能的網(wǎng)絡(luò)而引起的，LW-AFC是通過(guò)調(diào)節(jié)怎樣的分子網(wǎng)路而改善應(yīng)激致認(rèn)知功能的損傷。我們首先得到了在皮層中LW-AFC可調(diào)節(jié)的4個(gè)應(yīng)激引起差異表達(dá)的分子，即NEFH、PLAU、STAT3和STUB1，以它們作為種子來(lái)構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果我們得到了一個(gè)具有9個(gè)節(jié)點(diǎn)、10個(gè)邊，網(wǎng)絡(luò)直徑為4的特異的PPI網(wǎng)絡(luò)。其中網(wǎng)絡(luò)中的9個(gè)分子為MAPK1、STAT3、

32、AR、STUB1、NEFH、PLAT、PLAU、MET和HGF。提示，LW-AFC可能通過(guò)調(diào)節(jié)由MAPK1、STAT3、AR、STUB1、NEFH、PLAT、PLAU、MET和HGF多個(gè)分子組成的相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而改善急性多重應(yīng)激所引起的被動(dòng)回避反應(yīng)能力損害。
　　隨后我們結(jié)合 DAVID平臺(tái)上的GO功能注釋和 KEGG通路富集的方法分別對(duì)LW-AFC所調(diào)節(jié)的PPI網(wǎng)絡(luò)中的分子進(jìn)行功能分析，GO功能注釋結(jié)果顯示酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路

33、（enzyme linked receptor protein signaling pathway）排在首位。而KEGG通路富集的方法發(fā)現(xiàn)癌癥途徑（Pathways in cancer）排在首位。結(jié)果提示，LW-AFC所調(diào)節(jié)的相互作用分子可能參與酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路和癌癥途徑，即LW-AFC可能通過(guò)調(diào)節(jié)酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路或癌癥途徑（Pathways in cancer）的過(guò)程從而改善急性多重應(yīng)激對(duì)被動(dòng)回避反應(yīng)能力的損傷。
　　通

34、過(guò)以上研究，可以得到以下初步結(jié)論
　　1.不同程度的急性多重應(yīng)激程度依賴性地引起受試小鼠被動(dòng)回避反應(yīng)能力、物體識(shí)別記憶能力以及海馬和皮層中樹(shù)突和突觸結(jié)構(gòu)損傷。不同程度的急性多重應(yīng)激所引起受試小鼠血漿皮質(zhì)酮濃度升高與應(yīng)激程度無(wú)關(guān)，但應(yīng)激結(jié)束后血漿皮質(zhì)酮的恢復(fù)具有應(yīng)激程度依賴性，應(yīng)激程度越強(qiáng)，皮質(zhì)酮越難以恢復(fù)到正常狀態(tài)。
　　2.急性多重應(yīng)激引起樹(shù)突結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)而導(dǎo)致被動(dòng)回避反應(yīng)能力和物體識(shí)別記憶能力損傷所涉及的關(guān)鍵分子為 PLA