基于微針給藥的靶向黑素細(xì)胞抗色素沉著納米粒的研究.pdf

1、色素沉著造成的皮膚色斑影響了患者的生活質(zhì)量，卻尚未有理想的治療方法。正常皮膚顏色主要由皮膚中黑素含量決定。黑素來源于黑素細(xì)胞，黑素細(xì)胞位于表皮基底層，是皮膚中黑素合成的場(chǎng)所。黑素生成的生化過程：存在于黑色素細(xì)胞中的酪氨酸在酪氨酸酶、多巴色素互變酶、DHICA 氧化酶作用下經(jīng)多巴、多巴醌、多巴色素、二羥基吲哚等中間體逐步轉(zhuǎn)化成為真黑色素，在此過程中酪氨酸酶是黑素生成的起始限速酶，是黑素生成最重要的環(huán)節(jié)。皮膚中的激素：促黑素細(xì)胞激素（α-M

2、SH）和促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）可以和黑素細(xì)胞膜表面的黑皮素-1受體（MC1R）結(jié)合，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性增加，黑素細(xì)胞增殖加快，從而黑素含量增加。
　　 當(dāng)皮膚受到紫外線照射、炎癥刺激時(shí)，局部黑素單位的微環(huán)境發(fā)生變化，激素類與受體結(jié)合增加，合成黑素增多或細(xì)胞增殖加快，局部皮膚中出現(xiàn)色素沉著，造成膚色不均勻。目前抗色素沉著藥物以抑制酪氨酸酶活性藥物為主。
　　 本課題通過構(gòu)建以刺鼠蛋白（ASIP）為靶向頭

3、基的熊果苷（Arbutin）納米粒（NPs），由ASIP和熊果苷產(chǎn)生雙重抗色素沉著的作用。通過微針作用于色斑部位皮膚，促進(jìn)納米粒的經(jīng)皮遞送，并具有初步定位作用（皮層定位），納米粒進(jìn)入皮膚后可以通過ASIP特異性地結(jié)合黑素細(xì)胞表面的黑皮素1受體MC1R，產(chǎn)生再次定位（細(xì)胞定位）。
　　 因此基于微針給藥的ASIP修飾的載熊果苷納米粒具有雙重定位，雙重抗色素沉著作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，ASIP修飾的載熊果苷納米粒顯示出對(duì)黑素細(xì)胞具有良好

4、的靶向性和抗黑色生成效果。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)微針作用后，與熊果苷單一藥物相比，顯示出更加顯著的抗色素沉著效果。
　　 通過制備雙熒光納米粒研究基于微針給藥的納米粒經(jīng)皮遞送機(jī)理。采用共聚焦顯微鏡對(duì)納米粒經(jīng)微針給藥后的皮膚進(jìn)行斷層掃面，結(jié)果顯示納米粒經(jīng)由微針作用皮膚后產(chǎn)生的微孔滲透進(jìn)入皮膚；通過HPLC法測(cè)定皮膚及接收液中納米粒的分布，結(jié)果顯示48h后沒有納米粒進(jìn)入接收液；但微針可以顯著增加納米粒在皮膚內(nèi)的滯留量，并且納米粒在表皮層中

5、的滯留量大于真皮層；降低納米粒粒徑均可以增加納米粒皮膚滯留量。與裸鼠皮膚相比，微針對(duì)于人體皮膚中納米粒的促透效果更加明顯。
　　 經(jīng)體外黑素細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以藥效和安全性綜合評(píng)價(jià)，優(yōu)選美白藥物。結(jié)果表明熊果苷抑制酪氨酸酶活性和抑制黑素生成的效果較好，且其安全性最好。將熊果苷作為抗色素沉著的模型藥物制備納米粒，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選納米粒制備工藝，所制備的載熊果苷PLGA納米粒粒徑在200nm以內(nèi)，Zeta電位-30mv以上，能夠形成穩(wěn)定膠

6、體溶液，掃描電鏡觀察其外觀圓整，大小均一，分散性好。
　　 采用在EDC和NHS的偶聯(lián)將ASIP共價(jià)結(jié)合于熊果苷納米粒表面，實(shí)現(xiàn)靶向于黑素細(xì)胞MC1R受體的主動(dòng)靶向納米粒的構(gòu)建。所構(gòu)建的納米粒形態(tài)圓整，分散均勻，未發(fā)生粘連聚集等現(xiàn)象，說明靶向納米粒性質(zhì)穩(wěn)定。采用PE標(biāo)記ASIP，在流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡下觀察，證實(shí)ASIP已連接于納米粒的表面。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以共聚焦顯微鏡觀測(cè)靶向納米粒與靶細(xì)胞的內(nèi)吞過程，10min時(shí)靶向納

7、米粒已能夠識(shí)別并吸附于黑素細(xì)胞表面，2h時(shí)已大量進(jìn)入細(xì)胞漿；通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)靶向納米粒對(duì)于具有MC1R受體的黑素細(xì)胞靶向性能良好。
　　 體外藥效實(shí)驗(yàn)證實(shí)以ASIP修飾納米粒后，可以與黑素細(xì)胞MC1R受體特異性結(jié)合，并且可以拮抗α-MSH的與受體的結(jié)合，同時(shí)可以抑制由α-MSH引起的酪氨酸酶活性增強(qiáng)、黑素合成增加以及黑素細(xì)胞增殖。而且在酪氨酸酶活性抑制、黑素合成抑制方面，Arbutin-NPs-ASIP效果優(yōu)于單一Arbu