基于陽(yáng)離子聚合物-DNA納米復(fù)合物微針給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、DNA疫苗是將含有編碼抗原基因的真核表達(dá)質(zhì)粒直接接種體內(nèi),在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)抗原,以刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答,產(chǎn)生保護(hù)性免疫。它是在基因治療和轉(zhuǎn)基因技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生的第三代疫苗,是疫苗的一次革命。但目前DNA疫苗的給藥系統(tǒng)比較單一,主要是質(zhì)粒DNA凍干粉針,肌注給藥后,DNA進(jìn)入組織細(xì)胞,特別是到達(dá)樹(shù)狀突細(xì)胞(DCs)等抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APCs)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率較低,因而導(dǎo)致抗原表達(dá)水平低,免

2、疫效果不好。目前關(guān)鍵是在于缺乏高效低毒的DNA疫苗的傳遞系統(tǒng)。皮膚特別是在活性表皮層中存在著大量的樹(shù)狀突細(xì)胞(DCs)---郎格漢氏細(xì)胞(Langcrhans cells,500-1000 cells mm-2),這是一種高效的抗原提呈細(xì)胞(APCs),可產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫效應(yīng),因此活性表皮層被看作疫苗接種的最佳部位。然而DNA疫苗這樣的親水性大分子藥物是無(wú)法穿透皮膚角質(zhì)層的屏障,并且皮膚內(nèi)的酶系會(huì)對(duì)DNA疫苗產(chǎn)生降解作用,而使抗原提呈細(xì)胞

3、無(wú)法捕獲DNA疫苗。為此我們?cè)O(shè)計(jì)了陽(yáng)離子聚合物/DNA疫苗復(fù)合物微針給藥系統(tǒng)。微針(Microneedles)是指通過(guò)微電子機(jī)械工藝技術(shù)(MEMS)制作的,尺寸在微米級(jí),長(zhǎng)度100μm以上呈針狀的復(fù)雜結(jié)構(gòu),材料可以為硅、聚合物、金屬等。微針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。微針用于藥物傳輸系統(tǒng)具有精確、無(wú)痛、高效、便利的優(yōu)勢(shì)。利用微針給藥系統(tǒng)可主動(dòng)靶向于皮膚特定深度,即活性表皮層的郎格漢氏細(xì)胞。為了提高DNA疫苗在體內(nèi)的穩(wěn)定性,合成了基于聚乙

4、烯亞胺(PEI)的基因載體,選用兩親性的嵌段共聚物Pluronic(聚氧乙烯-聚環(huán)氧丙烷-聚氧乙烯嵌端共聚物)和Solutol(聚乙二醇-12羥基硬脂酸酯)修飾支鏈高分子量PEI,不但可以增加PEI/DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性,屏蔽復(fù)合物表面的正電荷,減小其對(duì)細(xì)胞的毒性作用,還因?yàn)镻luronic和Solutol分子中含有疏水基團(tuán),對(duì)細(xì)胞具有一定的親和力,不會(huì)顯著降低DNA疫苗體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率。以乙肝DNA疫苗為模型藥物,考察了陽(yáng)離子聚合物/D

5、NA疫苗復(fù)合物微針透皮給藥后的小鼠體內(nèi)免疫效果。 第一部分使用琥珀酰亞胺酯法活化非離子表面活性劑Pluronic或Solutol的末端羥基,得到活化率高,反應(yīng)活度大的產(chǎn)物。使用活化后的聚合物按不同比例對(duì)PEI進(jìn)行修飾。經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠純化,超濾脫鹽,冷凍干燥,成功的合成了一系列不同修飾度(每個(gè)PEI分子上分別接枝1個(gè)、2個(gè)、5個(gè)、10個(gè)和20個(gè)Pluronic或Solutol)的Craft-PEI聚合物。1H-NMR結(jié)果顯示,本方

6、法合成的陽(yáng)離子聚合物接枝率高,控制投藥量能定量地對(duì)PEI進(jìn)行修飾,其接枝率與反應(yīng)時(shí)投藥量的摩爾比呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,說(shuō)明該合成方法比較穩(wěn)定、可靠,產(chǎn)率高,具有良好的可控性。1H-NMR圖譜中未見(jiàn)其它雜質(zhì)峰,證明這些陽(yáng)離子聚合物的純度較高。 第二部分重點(diǎn)考察了陽(yáng)離子接枝聚合物/DNA復(fù)合物的相關(guān)性質(zhì)。凝膠電泳阻滯分析結(jié)果顯示,完全阻滯DNA所需的N/P值隨著PEI修飾度的增加而增大,隨著修飾物分子量的減小而減小。本實(shí)驗(yàn)所制備的PEI

7、/DNA、graft-PEI/DNA復(fù)合物粒徑在60-400 nm范圍內(nèi)。隨著復(fù)合物N/P值的增加,粒徑有減小的趨勢(shì)。高分子量的修飾物,在高修飾度時(shí)復(fù)合物的粒徑明顯增大。復(fù)合物的zeta電位隨N/P值的增加而增加；相同N/P值的復(fù)合物,其zeta電位隨表面活性劑接枝數(shù)的增加而減少；復(fù)合物的zeta電位在相同修飾度且相同N/P值時(shí),隨表面活性劑分子量的減小而略有增加。MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性的結(jié)果表明,使用表面活性劑修飾PEI可以不同程度地降

8、低其細(xì)胞毒性,在低濃度時(shí)每個(gè)PEI接枝一個(gè)表面活性劑的分子即可顯著降低細(xì)胞毒性。在高濃度時(shí)每個(gè)PEI接枝≥5個(gè)表面活性劑分子則可顯著降低細(xì)胞毒性。 第三部分評(píng)價(jià)了陽(yáng)離子接枝聚合物/DNA復(fù)合物體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效果。選用了兩種分別編碼綠色熒光蛋白和蟲(chóng)熒光素酶的質(zhì)粒。為了獲得蟲(chóng)熒光素酶在體內(nèi)較高的表達(dá),將CMV啟動(dòng)子克隆到蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL3-basic Luciferase Reporter vector中,構(gòu)建成重組的pGL3-

9、CMV Luciferase Reporter vector。陽(yáng)離子接枝聚合物/DNA復(fù)合物在Hela細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效果表明,低分子量的L61和Solutol修飾的PEI在低修飾度時(shí)不會(huì)顯著地降低轉(zhuǎn)染效果,低P123修飾度的PEI的最佳轉(zhuǎn)染效果與未修飾的PEI相似。隨著表面活性劑分子量增大,接枝率增加,其最佳轉(zhuǎn)染效率隨之下降。ICR小鼠尾靜脈注射復(fù)合物,測(cè)定各個(gè)臟器中蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá),除了肺部外,低修飾度的PEI最佳轉(zhuǎn)染效率顯著優(yōu)于未修飾

10、的PEI。 第四部分使用微電機(jī)技術(shù)制備了SU-8聚合物微針,考察了微針的機(jī)械強(qiáng)度,結(jié)果表明該微針陣列可以容易地穿破鋁箔和離體皮膚,并具有一定的堅(jiān)韌度,不易折斷?？疾炝宋⑨槍?duì)不同藥物的體外透皮促進(jìn)作用。首先考察了四種不同油水分配系數(shù)的小分子藥物(吲哚美辛、酮洛芬、美索巴莫、更昔洛韋),結(jié)果表明吲哚美辛的皮膚滲透速率增加4.05倍,酮洛芬的皮膚滲透速率增加4.77倍,美索巴莫的皮膚滲透速率增加6.06倍,更昔洛韋的皮膚滲透速率增加1

11、2.49倍,說(shuō)明logP值是影響藥物經(jīng)微針透皮傳遞速率的重要因素,微針對(duì)于水溶性藥物的透皮促進(jìn)作用較脂溶性藥物更加有利。又考察了四種不同分子量的生物大分子藥物(胰島素、溶菌酶、卵清白蛋白、人血清白蛋白),結(jié)果表明與無(wú)法透過(guò)完整的皮膚相比,生物大分子藥物可以透過(guò)微針陣列處理過(guò)的皮膚,經(jīng)皮滲透速率可以達(dá)到小分子藥物的水平。生物大分子藥物分子量與經(jīng)皮滲透速率成反比。 第五部分主要考察了DNA疫苗的體內(nèi)免疫效果。通過(guò)細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)證明了修

12、飾后的PEI其細(xì)胞吞噬過(guò)程未發(fā)生改變?？笵NAase I的保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明復(fù)合物可以有效地保護(hù)DNA不被降解。微針陣列可刺入小鼠活體皮膚,并在皮膚表皮層產(chǎn)生幾十微米的孔洞,提供了復(fù)合物穿透角質(zhì)層的通道。以乙肝疫苗為模型藥物,考察體內(nèi)免疫效果,分別測(cè)定血清中的抗體滴度,脾細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(γ-INF,IL-4),及脾細(xì)胞的增殖。與乙肝DNA疫苗復(fù)合物肌注和DNA疫苗水溶液肌注相比,陽(yáng)離子聚合物/DNA疫苗復(fù)合物微針經(jīng)皮給藥在第4周后可以顯著