嗜鉻粒蛋白A在擴(kuò)張型心肌病中的表達(dá)及其與心肌纖維化的關(guān)系和機(jī)制研究.pdf

1、嗜鉻粒蛋白A(CGA)廣泛分布于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),因其半衰期長而成為評(píng)估整個(gè)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)活性的強(qiáng)有力指標(biāo)。在擴(kuò)張型心肌病中,交感神經(jīng)興奮性的長期低水平增強(qiáng)對(duì)于疾病進(jìn)程具有激活作用;促進(jìn)心肌細(xì)胞死亡、凋亡和刺激心肌間質(zhì)膠原的增生重構(gòu),使心肌間質(zhì)膠原增加、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原比例失調(diào),從而使心肌細(xì)胞失去了堅(jiān)韌的膠原支持而變形,左心室在功能上從壓力泵轉(zhuǎn)換為容量泵,心室球形化,最終導(dǎo)致心衰?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在心血管系統(tǒng)中,CGA具有交感神經(jīng)抵抗作用,并與

2、慢性心衰癥狀的嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān);分子水平上CGA參與了對(duì)纖維母細(xì)胞的黏附和伸展作用,提示其與心肌重塑有關(guān)。然而CGA與心肌纖維化的作用目前未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)擬觀察CGA在擴(kuò)張型心肌病表達(dá)的量與部位的變化,探討CGA與心肌纖維化的關(guān)系,以進(jìn)一步研究神經(jīng)內(nèi)分泌因素在DCM中的作用,從而為臨床心肌纖維化的評(píng)估提供新的指標(biāo)和思路。
　　 已知在人體中,CGA作為一個(gè)前體肽,在不同的組織中被分解為不同的分泌片段發(fā)揮其相應(yīng)的作用。C

3、atestatin(Human CGA352-372),是CGA家族中的一員,也是目前為止已知的CGA家族中唯一直接作用于煙堿受體而發(fā)揮作用的。同時(shí)作為強(qiáng)有力的內(nèi)源性煙酸膽堿受體拮抗劑,抑制兒茶酚胺的釋放,并具有負(fù)性肌力作用。那么抑制兒茶酚胺的釋放和功能,是否對(duì)心肌細(xì)胞凋亡、成纖維細(xì)胞增殖和遷移有一定影響?目前為止尚未見有文獻(xiàn)資料。本研究擬通過catestatin抑制兒茶酚胺的作用,觀察心肌纖維化的發(fā)生,并進(jìn)一步探討catestatin

4、影響心肌纖維化的可能機(jī)制。
　　 第一部分嗜鉻粒蛋白A在擴(kuò)張型心肌病中的表達(dá)
　　 目的：觀察擴(kuò)張型心肌病(DCM)患者外周血及心肌組織中嗜鉻粒蛋白A(CGA)的表達(dá)。
　　 方法：收集DCM患者及正常健康志愿者外周血血清,用ELISA方法檢測(cè)樣本血清中CGA水平。取DCM心臟移植患者的廢棄心肌組織樣本,以及排除心臟疾病的腦外傷尸檢心肌組織標(biāo)本。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)心肌中嗜鉻粒蛋白(CGA)的mRNA在DCM

5、心肌和正常心肌中的表達(dá)變化;應(yīng)用免疫組化鑒定心肌中CGA的分布位置及其表達(dá)強(qiáng)弱變化。
　　 結(jié)果：ELISA顯示DCM病人外周血中CGA為187.6±94.7ng/ml;正常健康志愿者外周血中CGA為130.6±21.1ng/ml(P＜0.05)。和正常對(duì)照心肌相比,RT-PCR證實(shí)DCM心肌組織中CGA-mRNA表達(dá)升高(P＜0.001)。免疫組化表明在DCM心肌中CGA顆粒粗大、部位密集,與正常心肌樣本比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

6、0.05)。
　　 結(jié)論:作為神經(jīng)內(nèi)分泌活性強(qiáng)有力指標(biāo)的CGA在DCM心肌及外周血循環(huán)中表達(dá)均升高。
　　 第二部分?jǐn)U張型心肌病中嗜鉻粒蛋白A的表達(dá)與心肌纖維化的關(guān)系
　　 目的：觀察嗜鉻粒蛋白A(CGA)在擴(kuò)張型心肌病(DCM)中的表達(dá)、心肌纖維化程度及其二者間的關(guān)系,初步探討CGA在心肌纖維化進(jìn)程中的作用。
　　 方法：取DCM心臟移植患者的心肌組織標(biāo)本作為研究對(duì)象,排除心臟疾病的腦外傷尸檢心肌組織標(biāo)

7、本作為對(duì)照。利用Real-time PCR方法檢測(cè)心肌中嗜鉻粒蛋白A(CGA)及Ⅰ型膠原纖維(COLⅠ),Ⅲ型膠原纖維(COLⅢ)、基質(zhì)金屬蛋白酶(ADAMTS-1)的mRNA表達(dá),并分析其相關(guān)性。免疫組化技術(shù)鑒定心肌中CGA的分布位置及其表達(dá)強(qiáng)弱變化;運(yùn)用苦味酸天狼猩紅特異染色和偏振光顯微鏡顯像,并輔以圖象分析軟件計(jì)算心肌膠原容積積分(CVF);并對(duì)CGA與心肌纖維化的相關(guān)性進(jìn)行形態(tài)學(xué)上的比較。
　　 結(jié)果：免疫組化表明,CG

8、A在DCM心肌中表達(dá)增加(P＜0.05)。CVF證實(shí)DCM心肌中膠原容積積分較正常心肌增加(P＜0.001)。Real-time PCR證實(shí)心肌中CGA-mRNA與COLⅠ-mRNA、COLⅢ-mRNA、ADAMTS-1-mRNA三者均具有相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.729、0.95、0.665;形態(tài)學(xué)上,嗜鉻粒蛋白A呈現(xiàn)陽性的部位及其分布密集區(qū)域的附近,心肌纖維化明顯。
　　 結(jié)論：DCM心肌中CGA的表達(dá)與心肌纖維化具有密切的

9、相關(guān)性。由此可以推測(cè)DCM心肌組織中CGA的表達(dá)水平影響著心肌纖維化的發(fā)展。
　　 第三部分 catestatin抑制心肌纖維化的機(jī)制探討
　　 目的：擬通過CGA活性片段catestatin抑制兒茶酚胺的作用,觀察心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展,并進(jìn)一步探討catestatin影響心肌纖維化的可能機(jī)制。
　　 方法：按照人eatestatin序列(Human CGA352-372)合成此氨基酸序列,以HPLC分析其純度

10、。取1-3d的SD大鼠,在無菌條件下從心肌中利用差速貼壁法分離出心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。分別設(shè)立異丙腎上腺素(ISO)濃度組:10umol/L、20umol/L、40umol/L以及catestatin濃度組1umol/L、2umol/L、4umol/L、10umol/L、25umol/L。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的凋亡率,以觀察ISO對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用、以及catestatin是否對(duì)ISO刺激所造成的心肌損傷有修復(fù)

11、治療作用。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法(CCK-8)檢測(cè)不同濃度的catestatin對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用;采用細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度catestatin對(duì)成纖維細(xì)胞遷移的影響。
　　 結(jié)果：經(jīng)HPLC質(zhì)譜分析證實(shí),合成的catestatin純度為99.21％。FACS檢測(cè)顯示:ISO梯度濃度損傷組中,在單純使用不同濃度ISO刺激心肌細(xì)胞后,結(jié)果表明:隨著ISO濃度升高、心肌細(xì)胞凋亡比率增加(P＜0.001);catestatin

12、治療組中,預(yù)先使用ISO20umol/L損傷細(xì)胞、后采用不同濃度的catestatin治療,結(jié)果顯示:5個(gè)不同濃度的catestatin均能降低ISO(20umol/L)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡(P＜0.05),且該作用呈現(xiàn)濃度依賴性(P＜0.05)—即catestatin濃度越高,對(duì)ISO所造成的心肌細(xì)胞損傷的修復(fù)作用越明顯,心肌細(xì)胞凋亡率越低。CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與正常對(duì)照組相比,低濃度的catestatin(1umol/L)作用于成纖維

13、細(xì)胞24h后,即可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增值率下降,差別具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);在catestatin濃度達(dá)到4umol/L以后,其抑制作用即可呈現(xiàn)平臺(tái)期。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比,經(jīng)過catestatin作用后,成纖維細(xì)胞向劃痕內(nèi)遷移的距離較對(duì)照組有所縮小;在catestatin濃度達(dá)到4umol/L以后,開始出現(xiàn)抑制成纖維細(xì)胞遷移的作用(P＜0.001),隨著catestatin劑量的增大,抑制作用越明顯。