胞外組蛋白表達(dá)純化和細(xì)胞毒性機(jī)理研究.pdf

1、胞外組蛋白（也稱為循環(huán)組蛋白）是細(xì)胞在損傷、壓力或死亡狀態(tài)下釋放的一種具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，在膿毒癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性肺損傷等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。但由于缺乏合適的標(biāo)準(zhǔn)品，至今無(wú)法對(duì)患者體內(nèi)的胞外組蛋白進(jìn)行精確定量，導(dǎo)致多種感染性疾病無(wú)法根據(jù)血漿組蛋白含量對(duì)疾病進(jìn)行精確分級(jí)，也無(wú)法據(jù)此合理用藥。
　　本研究用大腸桿菌表達(dá)單體變性組蛋白H3和H4，親和純化后用梯度稀釋和透析方法，可以得到復(fù)性的組蛋白單體H3、H4以及H3

2、/H4復(fù)合物。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)在純化過(guò)程中穩(wěn)定性的比較，我們發(fā)現(xiàn)H3/H4復(fù)合物較單體更為穩(wěn)定，以同二聚的四聚體形式穩(wěn)定存在。以該復(fù)合物（50μg/mL）處理內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，細(xì)胞存活率約為20%，與小牛胸腺組蛋白（200?g/mL）的毒性類似。該復(fù)合物引起的細(xì)胞毒性可被人血清白蛋白以濃度依賴的形式（0.625 mg/mL?10 mg/mL）緩解，提示其構(gòu)象基本正確，且組蛋白與白蛋白之間存在某種方式不確定的相互作用。因此，重組組蛋白H3/

3、H4復(fù)合物可以作為精確定量組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品，若提高抗體靈敏度可擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，對(duì)基于組蛋白含量的疾病分級(jí)和組蛋白毒性機(jī)制的研究均有應(yīng)用價(jià)值。在此基礎(chǔ)上，本研究使用組蛋白H3/H4復(fù)合物作為藥物對(duì)HUVEC進(jìn)行低劑量長(zhǎng)時(shí)間處理并發(fā)現(xiàn)，不同于高劑量短時(shí)間內(nèi)組蛋白引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生焦亡，低劑量長(zhǎng)時(shí)間的組蛋白處理可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生持續(xù)的細(xì)胞死亡，caspase3的活化提示這種細(xì)胞死亡方式可能為細(xì)胞凋亡。此外利用細(xì)胞死亡相關(guān)抗體芯片檢測(cè)長(zhǎng)時(shí)間處理下