基于多種組學(xué)技術(shù)的鎳離子細(xì)胞毒性機(jī)理研究.pdf

1、鎳鈦合金作為一種常用的醫(yī)學(xué)材料，被用于整形科和心血管科等多個方面，如用于人造骨骼和牙齒、心血管支架等，但由于鎳鈦合金中含有約54.5％-56.3％的可能會致畸致癌的鎳元素，因此對鎳鈦合金和鎳離子的生物相容性研究非常必要。目前對鎳離子的生物相容性研究已經(jīng)在整體水平、細(xì)胞水平和分子水平上開展，但在分子水平的研究中大部分仍采用RT-PCR、ELISA等傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法對少量DNA、蛋白質(zhì)、代謝物等進(jìn)行分析，也有少量使用高通量的組學(xué)技術(shù)（如

2、基因表達(dá)譜芯片技術(shù)、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等）對單一分子層次整體水平進(jìn)行的研究，而將多種組學(xué)技術(shù)相結(jié)合以從系統(tǒng)生物學(xué)的角度探討鎳離子的細(xì)胞毒性機(jī)理則未見報道。
　　本論文的目的是首先采用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法分別在蛋白質(zhì)水平和代謝水平上研究鎳離子的細(xì)胞毒性機(jī)理;再與本課題組前期已完成的基因組學(xué)結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析，從多層次生物組學(xué)的系統(tǒng)生物學(xué)的角度闡述鎳離子的細(xì)胞毒性機(jī)理。
　　本論文的主要內(nèi)容如下:
　　1.蛋

3、白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn):以正常的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)L929細(xì)胞作為對照組，使用含不同濃度鎳離子的培養(yǎng)基培養(yǎng)L929細(xì)胞不同時間作為實(shí)驗(yàn)組，然后使用胰酶或裂解液收集細(xì)胞樣品（包括對照組和實(shí)驗(yàn)組），并寄送至公司進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)和代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　2.蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的生物信息學(xué)分析:統(tǒng)計各實(shí)驗(yàn)組中蛋白質(zhì)差異表達(dá)情況，在100μM的12h、24h和48h組中分別檢測到了158、1633、1587個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，在200μM的12h、24

4、h和48h組中分別檢測到了66、1292、1784個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，在6個實(shí)驗(yàn)組中共得到了22種共有的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中19個為功能性蛋白質(zhì)。使用DAVID和GenMAPP分別對各實(shí)驗(yàn)組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO（基因本體論）分析和生物學(xué)通路分析，6個實(shí)驗(yàn)組中均有多個GO功能類別受到了鎳離子影響，其中鎳離子濃度為200μM、作用時間為48h時L929細(xì)胞內(nèi)受影響的GO功能類別最多;6個實(shí)驗(yàn)組中均有蛋白質(zhì)發(fā)生差異表達(dá)的生物學(xué)通路共有16條

5、，有多條通路與細(xì)胞的粘附與遷移、細(xì)胞生長與增殖、細(xì)胞內(nèi)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)、能量代謝、炎癥反應(yīng)等相關(guān)，這與前期得到的基因組學(xué)結(jié)果有相似之處。
　　3.蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的驗(yàn)證:采用Western blot實(shí)驗(yàn)對蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，選取的五個蛋白質(zhì)在Western blot和蛋白質(zhì)組學(xué)中的表達(dá)模式完全一致，證明了基于iTRAQ技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠;采用ATP能量代謝檢測實(shí)驗(yàn)對蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果中鎳離子會對細(xì)胞內(nèi)的能量代謝過程產(chǎn)

6、生影響這一結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明隨著鎳離子作用濃度提高和作用時間增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著下降，鎳離子的確會影響細(xì)胞內(nèi)能量代謝過程。
　　4.代謝組學(xué)結(jié)果的分析:使用多種多元統(tǒng)計學(xué)分析方法對代謝組學(xué)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析并篩選，在100μM的12h、24h和48h組中分別檢測到了40、64、79種差異表達(dá)代謝物，在200μM的12h、24h和48h組中分別檢測到了41、77、64種差異表達(dá)代謝物。使用MetaboAnalyst在線

7、軟件對各個實(shí)驗(yàn)組的差異表達(dá)代謝物進(jìn)行了代謝通路分析，在6個實(shí)驗(yàn)組中全部出現(xiàn)的代謝通路僅有3條:苯丙氨酸代謝通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路（氨基酸代謝類）、氮素代謝通路（能量代謝類），表明了鎳離子對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成與代謝以及能量代謝過程產(chǎn)生了很大的影響。
　　5.三種組學(xué)結(jié)果的聯(lián)合分析:將基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)三個層次上的通路分析結(jié)果進(jìn)行了對比，篩選到在三個水平上均受鎳離子影響的三條通路:谷胱甘肽代謝通路、TCA循環(huán)通路和不飽