基于基因表達譜芯片技術(shù)的銀納米粒子細胞毒性機理研究.pdf

1、銀納米粒子由于小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)顯著增強，其殺菌能力相比傳統(tǒng)含銀抗菌材料產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍，是一種具有廣譜高效抗菌性能的新型納米生物材料，近幾年來在醫(yī)學研究領(lǐng)域獲得了非常廣泛的應(yīng)用。然而，由于目前還未形成納米材料安全性評價的標準體系，隨著越來越多的納米銀生物材料投入市場，納米銀的毒性作用及其機理研究逐漸引起了廣大科研工作者的關(guān)注。一些研究報道顯示，納米銀對大多數(shù)動物細胞產(chǎn)生細胞毒性，但細胞毒性機理尚不明朗。
　　 本論文的研究目的

2、是在銀納米粒子與細胞相互作用的檢測基礎(chǔ)上，采用基因表達譜芯片技術(shù)結(jié)合生物信息學分析，在基因表達水平上研究銀納米粒子對人皮膚成纖維細胞的細胞毒性機理，并為在分子水平上建立基于基因表達譜芯片技術(shù)的生物材料與細胞相互作用機理的研究方法打下基礎(chǔ)。
　　 本論文的具體工作如下：
　　 1.通過流式細胞術(shù)實驗對200μM，20 nm納米銀作用HDF-f細胞1、4、8 h后細胞周期和細胞凋亡率變化進行分析。結(jié)果顯示，納米銀作用后，細胞

3、可能出現(xiàn)DNA損傷，并導(dǎo)致細胞周期的停滯；與正常培養(yǎng)的細胞相比，納米銀作用后，細胞凋亡率沒有發(fā)生顯著變化，而8h的凋亡率在三個時間點中相對最高，表明納米銀誘導(dǎo)的細胞凋亡可能隨著時間變化逐漸顯現(xiàn)。
　　 2.以正常培養(yǎng)的HDF-f細胞作為正常對照組，200μM，20 nm納米銀處理1、4、8 h后的細胞作為實驗組，采用Illumina公司的全基因組表達譜芯片Human-6 V3 Expression BeadChip Array進

4、行了基因表達譜芯片實驗，篩選出了三個時間點不重復(fù)的共計1593個差異表達基因；通過熒光定量RT-PCR實驗驗證了芯片實驗的可靠性和準確性。
　　 3.應(yīng)用Cluster&TreeView軟件對200μM，20 nm銀納米粒子作用HDF-f細胞1、4、8h后的差異表達基因進行了層次聚類，獲得了具有不同表達模式的五個基因簇；應(yīng)用DAVID功能注釋工具對五種表達模式的基因簇分別進行基因本體論（Gene Ontology，Go）注釋分析

5、，得到了不同表達模式中所含基因在GO功能中的不同分布情況，對基因表達水平上銀納米粒子對HDF-f細胞作用情況的時序性變化進行了初步分析；應(yīng)用GoSurfer軟件分析了差異表達基因在GO生物學過程、分子功能、細胞組分三個層次的功能分布情況，獲得了比較全面的差異表達基因的GO功能分布概況；
　　 4.應(yīng)用GenMAPP軟件對200μM，20 nm銀納米粒子作用HDF-f細胞1、4、8 h后的差異表達基因參與的生物學途徑（Pathwa

6、y）進行分析。在GenMAPP數(shù)據(jù)庫中找到的差異表達基因共有396個，共得到包含差異表達基因的MAPPs90個，對其中14個MAPPs代表的生物學途徑進行了詳細討論。
　　 5.應(yīng)用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析平臺對200μM，20 nm銀納米粒子作用HDF-f細胞1、4、8 h后的差異表達基因進行分析。IPA根據(jù)每個網(wǎng)絡(luò)中的基因關(guān)聯(lián)程度對網(wǎng)絡(luò)進行打分，對打分最高的前5個網(wǎng)絡(luò)進行具體分析。<

7、br>　　 6.綜合聚類、GO分析、生物學途徑分析和基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果，對銀納米粒子與細胞相互作用的分子機理進行總結(jié)，得到了銀納米粒子的細胞毒性機理的初步解釋。將本論文的研究結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)文獻報道的結(jié)果進行了比較和討論，發(fā)現(xiàn)本論文獲得的結(jié)論與文獻報道存在一致性，說明本論文的技術(shù)路線可以在一定程度上與傳統(tǒng)的生物學實驗可以互為補充與印證，并且更為高效，更容易獲得整體的細胞毒性機理解釋。另外，與同樣利用基因表達譜芯片技術(shù)的文獻報道