可結(jié)合纖維素的五聚體化單鏈抗體的異源表達(dá)與純化.pdf

1、目的:構(gòu)建可結(jié)合纖維素的五聚體化單鏈抗體原核表達(dá)載體系統(tǒng)，并進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)與純化。
　　方法:
　　1.載體構(gòu)建:利用基因克隆技術(shù)通過PCR獲得大豆胰蛋白酶抑制劑單鏈抗體基因片段，并將所得DNA片段分別克隆到含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)載體pET37b及不含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的載體pET22b上;同時利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出大腸桿菌VT1B五聚體化結(jié)構(gòu)域基因片段，再將五聚體化結(jié)構(gòu)域片段插入含有蛋白酶抑制劑單鏈抗體基因的載體

2、上，獲得含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域-五聚體化結(jié)構(gòu)域-單鏈抗體——多組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白的原核表達(dá)構(gòu)建體。
　　2.蛋白表達(dá):將所獲得的含有目的基因的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21表達(dá)菌株中，用0.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)表達(dá)一定時間后，收集細(xì)胞、超聲破碎，收集細(xì)胞裂解液和沉淀，鑒定目的蛋白的表達(dá)。分離包涵體、用8M尿素溶解包涵體，獲得含有目的蛋白的包涵體溶解液。
　　3.蛋白純化:預(yù)處理Ni-NTA樹脂柱，將收集的含有目的蛋白的細(xì)

3、胞裂解液或包涵體溶解液與Ni-NTA樹脂柱進(jìn)行結(jié)合，洗去部分雜蛋白，最后用含有0.4M咪唑的洗脫液將蛋白從用Ni-NTA樹脂上洗脫下來，鑒定并保存洗脫下來的初步純化的目的蛋白。
　　4.蛋白復(fù)性:用透析的方法，將尿素變性后的蛋白通過逐步去除尿素，降低變性劑濃度，使恢復(fù)蛋白活性。
　　5.親和層析:將復(fù)性的蛋白與纖維素柱共同孵育，利用親和層析的原理，目的蛋白可與纖維素結(jié)合，洗去雜蛋白，將目的蛋白從纖維素柱中洗脫下來，經(jīng)SDS-

4、PAGE電泳后，用考馬斯亮藍(lán)法染色，比較蛋白與纖維素的親和力。
　　結(jié)果:
　　1.獲得多個含有大豆胰蛋白酶抑制劑單鏈抗體的原核表達(dá)載體，包括1）不含有五聚體化結(jié)構(gòu)域、不含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑單鏈抗體表達(dá)載體pET22b-1X;2）含有五聚體化結(jié)構(gòu)域、不含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑單鏈抗體表達(dá)載體pET22b-260;3）不含有五聚體化結(jié)構(gòu)域、含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑單鏈抗體表達(dá)載體pET37b-

5、1X;及4）既含有五聚體化結(jié)構(gòu)域、也含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑單鏈抗體表達(dá)載體pET37b-260。
　　2.經(jīng)誘導(dǎo)得到大量目的蛋白，大部分目的蛋白大量表達(dá)在包涵體沉淀中，少部分在上清液中。
　　3.通過Ni-NTA樹脂可對目的蛋白進(jìn)行純化，但仍然存在大量非特異性蛋白。
　　4.纖維素柱可與有活性的蛋白結(jié)合，經(jīng)過纖維素再次純化，目的蛋白獲得進(jìn)一步純化，得到純度較高的目的蛋白。
　　5.五聚體化融合蛋白對纖

6、維素的親和力可增強(qiáng)2倍，可進(jìn)一步提高目的蛋白的純度。
　　結(jié)論:
　　1.纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域-五聚體化結(jié)構(gòu)域-單鏈抗體融合蛋白可以在大腸桿菌中獲得高效表達(dá);
　　2.單鏈抗體本身及各種融合蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性受到限制，通過包涵體變性劑處理、純化并復(fù)性操作，融合蛋白的活性可恢復(fù);
　　3.纖維素可純化可結(jié)合纖維素的五聚體化單鏈抗體;
　　4.五聚體化結(jié)構(gòu)域可增強(qiáng)可結(jié)合纖維素的單鏈抗體融合蛋白與纖維素