抗β淀粉樣蛋白人源性單鏈抗體表達(dá)、純化流程的建立及其抗原表位鑒定.pdf

1、β淀粉樣蛋白(Amyloid β，Aβ)是比較公認(rèn)的阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)的原發(fā)性致病因子，Aβ在腦內(nèi)的異常聚合和沉積是AD發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。靶向Ap的被動(dòng)免疫治療已在AD模型動(dòng)物上取得顯著效果，但抗體的鼠源性限制了其在人體的應(yīng)用。研制合適的人源化抗體是開(kāi)展人體Aβ免疫療法的首要條件。利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)獲得的單鏈抗體為全人源性，更適用于人體。 本課題組之前已經(jīng)以Aβ<,1-40>為靶標(biāo)，

2、篩選噬菌體單鏈抗體庫(kù)獲得了抗Aβ<,1-40>單鏈抗體E3(Single chain variable fragment E3，E3 scfv)的基因片段，并對(duì)單鏈抗體E3初步進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。 本研究在固定誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和誘導(dǎo)表達(dá)溫度的條件下，采用不同終濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE分析全菌目的蛋白質(zhì)E3scfv的表達(dá)水平，確定了E3 scfv在20℃誘導(dǎo)表達(dá)18h時(shí)，所需誘導(dǎo)劑IPTG的最佳濃度為0.1mM；純

3、化時(shí)，對(duì)樣品依次用含咪唑10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50mM、60mM、70mM、80 mM、90 mM、100 mM、1 M的結(jié)合液各5 ml進(jìn)行洗脫，收集各管洗脫液，進(jìn)行Western blotting鑒定，確定了預(yù)洗液含咪唑的最佳濃度為10mM，為E3 scfv建立了穩(wěn)定的表達(dá)、純化流程。以純化的E3 scfv為固定相，篩選噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)，通過(guò)四輪淘篩，隨機(jī)挑選了94個(gè)噬菌體進(jìn)行ELISA分析，選取其中24

4、個(gè)強(qiáng)陽(yáng)性噬菌體克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，得到唯一序列，其相應(yīng)的氧基酸序列為F T P Y P L T A P V G S。將該序列與Aβ<,1-40>的氨基酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其VGS氨基酸序列存在于Aβ<,1-40>的24-26位。我們又選取了ELISA讀值最低的4個(gè)克隆噬菌體進(jìn)行DNA序列分析，結(jié)果表明，它們含兩個(gè)不同序列即：D T T G H M R G P ST L和I C T P W R S G C M A S，與陽(yáng)性序列均無(wú)同源性。