抗腎小球基底膜抗體的中和性單鏈抗體的篩選、表達(dá)、鑒定與應(yīng)用.pdf

1、抗腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)病指的是循環(huán)中抗GBM抗體在臟器中沉積所引起的一組自身免疫性疾病。其特點(diǎn)是在外周血中可檢測(cè)到抗GBM抗體，或腎活檢病理在腎小球基底膜上見到抗GBM抗體呈線樣的沉積?？笹BM抗體是公認(rèn)的致病性抗體，它的靶抗原也稱為Goodpasture(GP)抗原，即基底膜Ⅳ型膠原α3鏈的非膠原區(qū)1[α3(Ⅳ)NC1]。在正常情況下，該抗原隱蔽在基底膜Ⅳ型膠原的非膠原區(qū)中。

2、在環(huán)境因素或其它因素的作用下，一旦該抗原決定簇暴露，即可誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。抗GBM病大多病情兇險(xiǎn)，起病急、進(jìn)展快，是預(yù)后最差的腎臟病之一。盡管目前臨床上采用血漿置換與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺進(jìn)行治療，仍有少數(shù)患者早期死于肺大出血。尤其是血漿置換療法僅能清除循環(huán)中游離的抗GBM抗體，而不能徹底清除已經(jīng)與GBM結(jié)合的抗體，不僅費(fèi)用昂貴，還有可能增加血液傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。而聯(lián)合應(yīng)用大劑量糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺進(jìn)行沖擊治療，倒是可以抑制疾病早期免疫炎

3、癥反應(yīng)，但是這種療法同時(shí)也抑制了全身的免疫防御反應(yīng)，會(huì)加重或誘發(fā)感染。因此，如何能夠特異性的抑制抗GBM病的免疫反應(yīng)將成為富有前景的課題。
　　 噬菌體展示技術(shù)是目前一項(xiàng)極其重要的抗體工程技術(shù)，它可以直接從抗體庫(kù)中篩選出特異性噬菌體抗體，并將抗體片段呈現(xiàn)于噬菌體的表面。噬菌體抗體兼?zhèn)淞硕嗫寺】贵w和單克隆抗體的很多性能，而且可以經(jīng)過很容易的改建，在大腸桿菌或酵母菌中進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)。因此，噬菌體抗體在疾病的診斷與治療中表現(xiàn)出非常巨

4、大的潛能和廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本研究即運(yùn)用新型的噬菌體展示技術(shù)，擬從噬菌體抗體庫(kù)中篩選出抗GBM抗體的中和性單鏈抗體基因，然后利用基因工程重組技術(shù)，將篩選出來(lái)的單鏈抗體基因進(jìn)行克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建，最后通過誘導(dǎo)和親和層析技術(shù)獲得了純化的抗GBM抗體的中和性單鏈抗體蛋白，并在體內(nèi)外驗(yàn)證單鏈抗體蛋白是否可與抗GBM抗體進(jìn)行特異性的結(jié)合，從而阻滯或減輕抗GBM抗體與靶抗原結(jié)合所產(chǎn)生的臟器損害，希望能為抗GBM病提供更多的治療手段和

5、實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.純化抗GBM病患者血清中的抗GBM抗體，采用噬菌體表面展示技術(shù)，獲得一個(gè)與人抗GBM抗體結(jié)合活性較強(qiáng)的單鏈可變區(qū)抗體片段的陽(yáng)性克隆，并對(duì)該克隆序列進(jìn)行DNA序列測(cè)定分析。
　　 2.用PCR擴(kuò)增抗GBM抗體單鏈抗體scFv3基因，將scFv3 DNA與pGEM-T Easy質(zhì)粒連接，構(gòu)建克隆載體pGEM-scFv3。用酶切電泳驗(yàn)證重組表達(dá)結(jié)果正確；測(cè)序檢測(cè)質(zhì)粒重組后序列有無(wú)改變

6、。再將scFv3亞克隆入表達(dá)載體pQE-80L，構(gòu)建pQE80L-scFv3重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta2菌，通過酶切進(jìn)行鑒定。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白后，通過SDS-PAGE、Western blot和競(jìng)爭(zhēng)抑制法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
　　 3.將Wistar大鼠隨機(jī)分為五組：(1)腎炎模型組：經(jīng)尾靜脈注入患者抗GBM抗體(1.5mL/100g)。(2)對(duì)照Ⅰ組：經(jīng)尾靜脈注入0.4g/L的正常人IgG(1.5mL/100g)

7、。(3)對(duì)照Ⅱ組：經(jīng)尾靜脈注入抗GBM抗體的中和性單克隆抗體(1.5mL/100g)。(4)干預(yù)Ⅰ組：經(jīng)尾靜脈注入人抗GBM抗體(1.5mL/100g)，第7天后再經(jīng)尾靜脈注入抗GBM抗體的中和性單克隆抗體(1.5mL/100g)。(5)干預(yù)Ⅱ組：經(jīng)尾靜脈注入人抗GBM抗體(1.5mL/100g)，第14天后再經(jīng)尾靜脈注入抗GBM抗體的中和性單克隆抗體(1.5mL/100g)。分別在第7天、第14天、第21天觀察大鼠的24尿蛋白定量，尿

8、素氮，肌酐，腎組織病理學(xué)的變化。計(jì)量資料均以x±s表示。組間差異比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理。
　　 結(jié)果：
　　 1.對(duì)噬菌體單鏈可變區(qū)抗體庫(kù)經(jīng)過3輪的篩選后，與第1輪相比富集了137倍。檢測(cè)噬菌體抗體與人抗GBM抗體的結(jié)合活性，其中有35株克隆ELISA的吸光度較高。對(duì)這些噬菌體抗體進(jìn)行變叉反應(yīng)后，確定其中有10株交叉反應(yīng)較弱。

9、確定1株(C31)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行DNA序列測(cè)定，DNA大小為750bp，并符合人源化單鏈可變區(qū)抗體的序列結(jié)構(gòu)。
　　 2.PCR擴(kuò)增scFv3 DNA片段約為750bp，與預(yù)期結(jié)果相同；克隆載體pGEM-scFv3酶切后顯示scFv3成功的克隆入pGEM-T Easy質(zhì)粒；測(cè)序驗(yàn)證插入片段全序列無(wú)改變；表達(dá)載體pQE80L-scFv3酶切圖譜與預(yù)期相同；SDS-PAGE顯示，在分子量約為27kD處可見目的蛋白帶，West

10、ern blot和競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)scFv3能與抗GBM抗體特異性結(jié)合。
　　 3.第21天干預(yù)Ⅰ組24小時(shí)蛋白尿定量為(16.62±5.53)g/d、BUN為(11.53±2.26)mmol/L、Scr(102.46±16.86)μ mol/L，均顯著低于腎炎模型組(P<0.05)，干預(yù)Ⅱ組較腎炎模型組也有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)Ⅰ組和干預(yù)Ⅱ組較腎炎模型組腎臟細(xì)胞增生、新月體的形成及免疫復(fù)合物的沉積均減