山羊卵巢miRNAs的克隆、測序及表達(dá)鑒定.pdf

1、目前我國養(yǎng)羊業(yè)仍存在著如缺乏高繁殖力山羊品種、產(chǎn)羔率較低等問題。而闡明山羊卵巢功能機(jī)制，提高山羊產(chǎn)羔率，培育高產(chǎn)新品種是解決這些問題的關(guān)鍵。過去的40余年，在山羊繁殖性能研究上取得了很大的突破，但還有許多問題需要深入研究，目前山羊的卵泡發(fā)育、選擇、排卵等機(jī)制尚未明確，影響多數(shù)排卵的因素不清楚。卵巢是一個周期性發(fā)育的組織，其中卵泡生成和成熟、激素合成及排卵等過程受到眾多因素的復(fù)雜調(diào)控。microRNAs（miRNAs）是一種小的內(nèi)源性非編

2、碼RNA分子，大約由21-25個核苷酸組成，作用于一個或者多個靶標(biāo)mRNA，通過轉(zhuǎn)錄后水平的斷裂或翻譯水平的抑制而調(diào)控基因的表達(dá)。越來越多的研究證實卵巢表達(dá)的miRNAs對卵巢及卵泡功能有重要的作用，但是miRNAs影響繁殖性能的功能研究還相對匱乏，這些研究多集中在小鼠或大鼠上。而山羊的卵泡發(fā)育和排卵機(jī)制與小鼠有很大差異。針對以上問題，有必要明確山羊卵巢表達(dá)的miRNA群并鑒定組織細(xì)胞的表達(dá)譜，可以補(bǔ)充和完善山羊繁殖性能機(jī)理研究，也對卵

3、巢疾病治療、卵泡儲備資源的開發(fā)等領(lǐng)域提供重要的參考價值和意義。
　　 本研究以多胎大足黑山羊及單胎內(nèi)蒙古絨山羊的卵巢為研究材料，首先通過高通量測序技術(shù)確定山羊卵巢組織細(xì)胞表達(dá)的miRNAs;在此基礎(chǔ)上利用RT-qPCR檢測21個拷貝數(shù)高的miRNAs在卵巢及其他組織中的表達(dá)豐度，同時利用生物信息學(xué)手段預(yù)測這些miRNAs的作用靶基因。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.通過對大足黑山羊和內(nèi)蒙古絨山羊卵巢小RNA cDNA混合文

4、庫的測序，得到188個成熟的miRNAs序列，其中包括80個在miRBase v17.0中已報道的已知miRNAs，106個在miRBase v17.0中有高度同源的最佳候選miRNAAs以及2個在miRBase v17.0中無任何同源序列的新miRNAs;這些新的miRNAs中155個隸屬于89個miRNA家族，33個不屬于任何家族。對188個miRNAs序列進(jìn)行了系統(tǒng)的命名，明確了山羊基因組上的座位及正負(fù)鏈上的位置。
　　

5、2.通過PITA靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miRNAs的靶基因，得到與繁殖功能有重要關(guān)系的靶基因14種，同時利用基因本體論GO(Gene Ontology)分類對靶基因功能進(jìn)行了系統(tǒng)的分類，結(jié)果表明這些基因可能參與包括細(xì)胞膜成分、分子功能及生物學(xué)進(jìn)程的多個環(huán)節(jié)。
　　 3.運用熒光定量qPCR技術(shù)對山羊卵巢及其他組織進(jìn)行miRNAs表達(dá)豐度鑒定，檢測到了10種相對表達(dá)量較高的miRNAs(chi-miR-2209d-3p、chi-miR

6、-2567d-5p、 chi-miR-4465a-5p、 chi-miR533g-3p、 chi-miR-100f-5p、chi-miR-M1-16-5p、 chi-miR-1491 a-5p、 chi-miR-152c-3p、 miR-191-5p和miR-241 a-5p);山羊卵巢中高表達(dá)的chi-miR-2209d-3p在大足黑山羊卵巢中的表達(dá)顯著高于內(nèi)蒙古絨山羊且差異極顯著(p＜0.01);這些miRNAs在心、肝、脾、肺、腎