藍(lán)耳病病毒克隆測序、單克隆抗體制備及唾液酸粘附素的克隆表達(dá).pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,PRRSV)引起的接觸性傳染病。該病主要引起妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸道癥狀和高死亡率。該病于1987年首先發(fā)現(xiàn)于美國,隨后波及多個(gè)國家和地區(qū)。我國1

2、991年在臺灣發(fā)現(xiàn)該病,郭寶清在1996年首次從流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSV,證實(shí)了PRRSV在我國的存在(郭寶清,1996)。2006年下半年的“無名高熱”疫情在我國南方大面積暴發(fā),最后確診為高致病性PRRS。該病造成較高的發(fā)病率和死亡率,而且臨床癥狀逐漸復(fù)雜,流行范圍逐漸擴(kuò)大。目前PRRS已經(jīng)遍及全球主要養(yǎng)豬的國家和地區(qū),給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 本課題共分為三部分:
　　 1 PRRSV變異毒株SD-

3、TA株的分離鑒定及序列分析
　　 2008年從豬“高熱病”病料中分離到一株豬繁殖與呼吸綜合征病毒(SD-TA株),該病毒能夠被抗PRRSV陽性豬血清所識別。根據(jù)GenBankPRRSV經(jīng)典株(VR-2332)和變異株(JXA1)基因序列分別設(shè)計(jì)合成了10對引物,利用RT-PCR擴(kuò)增其基因序列,分別得到了預(yù)期的基因片段,將擴(kuò)增的cDNA片段克隆入pMD18-T載體并測序。應(yīng)用DNASTAR軟件分析,與國內(nèi)外已發(fā)表毒株的序列進(jìn)行比較

4、。結(jié)果顯示,與美洲型相比,PRRSVSD-TA株相應(yīng)基因核苷酸同源性為89.3％～99.1％,并且在Nsp2上缺失了30個(gè)氨基酸；與歐洲型代表毒株LV株相比同源性為59.9％。遺傳關(guān)系表明:SD-TA株屬于高致病性變異株。
　　 2豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的原核表達(dá)、純化與單克隆抗體的制備
　　 將豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)VR-2332株的N蛋白基因的重組質(zhì)粒pET-30 a(+)-ORF7經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)化入

5、Rosetta感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析,表達(dá)的重組蛋白大小約為21KD。將純化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合,以表達(dá)的融合蛋白作為包被抗原,通過間接ELISA方法對融合細(xì)胞上清進(jìn)行抗體檢測,并通過有限稀釋法,獲得了1株能穩(wěn)定分泌抗N蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株,將其命名為6D10。經(jīng)Western-blot檢測,所獲得的單克隆抗體6D10能與N蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),并經(jīng)間接免疫熒光

6、檢測結(jié)果表明,所獲得的單克隆抗體6D10能與PRRSV經(jīng)典株(VR、BJ和疫苗株MLV)和高致病性變異株(SD-TA、2＃和4＃株)產(chǎn)生特異性反應(yīng)。
　　 3唾液酸粘附素的克隆測序、表達(dá)以及蛋白純化
　　 根據(jù)GenBank NM-214346基因序列分別設(shè)計(jì)了5對引物,從PAM細(xì)胞中利用RT-PCR擴(kuò)增唾液酸粘附素基因序列,結(jié)果分別得到了預(yù)期的基因片段,其大小分別為:1125bp、1062bp、1101bp、1182b