豚鼠過敏性休克組織中相關(guān)介質(zhì)的表達(dá)及法醫(yī)學(xué)意義.pdf

1、前言: 過敏性休克(anaphylactic shock)屬于速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，是IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)中最為危重與急驟的一種。過敏性休克可以出現(xiàn)皮膚、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)的癥狀和體征，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致患者死亡，經(jīng)常引起醫(yī)療糾紛和民事訴訟。 過敏性休克死亡尸體常無特異性病理學(xué)改變，其法醫(yī)學(xué)診斷也缺乏明確的客觀指標(biāo)。過敏性休克的發(fā)生是由于肥大細(xì)胞脫顆粒所釋放的各種介質(zhì)發(fā)揮其作用生物學(xué)所致。類胰蛋白酶(trypta

2、se)和胃促胰酶(chymase)是肥大細(xì)胞中兩種中性絲氨酸蛋白酶，其分子量大于其他致過敏性反應(yīng)的介質(zhì)，且其理化性質(zhì)穩(wěn)定，因此，類胰蛋白酶和胃促胰酶被認(rèn)為是肥大細(xì)胞脫顆粒的重要標(biāo)志。 白細(xì)胞介素5(IL-5)是嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)趨化因子之一，是Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)中主要的效應(yīng)因子。組織中IL-5的表達(dá)主要限于哮喘的研究，而關(guān)于過敏性休克發(fā)生后IL-5在體內(nèi)的表達(dá)情況，尚缺乏深入的研究。 本研究在建立豚鼠過敏性休克的動(dòng)物模型基

3、礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察人混合血清致豚鼠過敏性休克死亡體內(nèi)多臟器組織中類胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5的表達(dá)情況，通過病理學(xué)觀察和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并結(jié)合《醫(yī)療事故處理?xiàng)l例》所規(guī)定的保存條件，來評(píng)定這三種介質(zhì)在過敏性休克診斷中的意義，為過敏性休克死亡的法醫(yī)學(xué)鑒定提供形態(tài)學(xué)依據(jù)和指標(biāo)。 材料和方法: 一、動(dòng)物模型的建立及分組 健康成年豚鼠24只，隨機(jī)分為死亡即時(shí)組、冷藏48小時(shí)組和冷凍7天組，每組8只，每組又分實(shí)驗(yàn)

4、組和對(duì)照組，每組4只。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用人混合血清誘發(fā)豚鼠發(fā)生過敏性休克死亡；對(duì)照組豚鼠采用生理鹽水代替血清，乙醚麻醉過量致死，提取兩組豚鼠心血制備血清備檢，取喉頭、氣管、雙肺、胃等器官，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋。準(zhǔn)備明確過敏性休克死亡和非過敏性休克死亡實(shí)際案例各5例進(jìn)行初步探索性觀察研究. 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、應(yīng)用HE染色法觀察組織的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)； 2、采用鉻變素2R染色法觀察組織中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況； 3、使

5、用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清中IgE水平： 4、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法觀察類胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5在組織中的表達(dá)情況； 5、使用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)計(jì)算免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞數(shù)及表達(dá)面積； 6、應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、HE染色見過敏性休克的豚鼠喉頭、氣管等器官水腫，肺泡擴(kuò)張，肺泡壁變??； 2、鉻變素2R染色后

6、見實(shí)驗(yàn)組各臟器組織內(nèi)較多嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)； 3、實(shí)驗(yàn)組血清IgE水平明顯高于對(duì)照組； 4、對(duì)照組各組可見散在類胰蛋白酶和胃促胰酶免疫組織化學(xué)染色陽性的肥大細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)完整，染色產(chǎn)物分布于細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色。實(shí)驗(yàn)組類胰蛋白酶和胃促胰酶染色陽性細(xì)胞增多，表達(dá)增強(qiáng)，而且染色產(chǎn)物部分彌散到肥大細(xì)胞周圍及組織間隙；對(duì)照組可見散在IL-5陽性細(xì)胞，染色產(chǎn)物位于胞漿內(nèi)。實(shí)驗(yàn)組IL-5陽性細(xì)胞形態(tài)不完整，染色產(chǎn)物大部分彌散到細(xì)胞周圍

7、和組織間隙。使用Motic Image Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各組免疫組織化學(xué)陽性染色面積，通過SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在相同保存條件下仍然存在較大差異； 5、實(shí)際案例中非過敏性休克死亡者類胰蛋白酶和胃促胰酶免疫組織化學(xué)染色陽性顆粒出現(xiàn)于肥大細(xì)胞胞漿內(nèi)，肥大細(xì)胞形態(tài)完整；過敏性休克死亡者大部分免疫組織化學(xué)染色產(chǎn)物彌散至肥大細(xì)胞周圍和組織間隙，肥大細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。 討論: 過敏性休

8、克是臨床上常見的一種速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，主要是由IgE介導(dǎo)，為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)中最為危重與急驟的一種，常可導(dǎo)致患者猝死，因此，在法醫(yī)學(xué)鑒定工作中經(jīng)常接觸到。 過敏性休克的發(fā)生是由于個(gè)體在接受變應(yīng)原刺激后，產(chǎn)生IgE類抗體，當(dāng)相應(yīng)的抗原再次進(jìn)入機(jī)體時(shí)通過與致敏肥大細(xì)胞表面的兩個(gè)或兩個(gè)以上相鄰IgE抗體特異結(jié)合，使膜表面的FcεRI(FC受體)交聯(lián)活化，最終導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒，從而引發(fā)過敏性休克的各種臨床征象。 過敏性休克死亡者，心

9、血中IgE的濃度往往增高，組織中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增多。但I(xiàn)gE受外界因素影響較大，嗜酸性粒細(xì)胞也不是過敏性休克所特有，缺乏一定的客觀性。 過敏性休克發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制是肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放介質(zhì)引起相應(yīng)的癥狀和體征。如何證明肥大細(xì)胞脫顆粒是診斷過敏性休克的關(guān)鍵問題。類胰蛋白酶和胃促胰酶是肥大細(xì)胞內(nèi)兩種重要的絲氨酸蛋白酶，同時(shí)它們的性質(zhì)非常穩(wěn)定，肥大細(xì)胞發(fā)生脫顆粒時(shí)它們也會(huì)隨之脫出到細(xì)胞外和組織間隙中。IL-5是嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子

10、，在嗜酸性粒細(xì)胞增多的疾病中，其表達(dá)將會(huì)增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同保存條件下類胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察，證實(shí)了這3種介質(zhì)在過敏的豚鼠體內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，類胰蛋白酶和胃促胰酶也明顯地反映出肥大細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象。因此，類胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5的免疫組織化學(xué)染色可以為過敏性休克的診斷提供新的形態(tài)學(xué)依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)將所使用的類胰蛋白酶和胃促胰酶免疫組織化學(xué)染色法應(yīng)用于實(shí)際案例中，結(jié)果表明非過敏性休克死亡

11、的標(biāo)本兩種蛋白酶表達(dá)的情況反映出肥大細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)，而過敏性休克死亡的標(biāo)本內(nèi)兩種酶表達(dá)增強(qiáng)，染色產(chǎn)物脫出于肥大細(xì)胞外及周圍組織間隙，肥大細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，因此，類胰蛋白酶和胃促胰酶的免疫組織化學(xué)染色法有望應(yīng)用于過敏性休克的法醫(yī)學(xué)實(shí)際案例的診斷。 結(jié)論: 1、HE染色見過敏性休克的豚鼠喉頭、氣管等器官水腫，肺泡擴(kuò)張，肺泡壁變??； 2、過敏性休克的豚鼠臟器經(jīng)過鉻變素2R染色后，各臟器內(nèi)出現(xiàn)了明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況

12、； 3、過敏性休克豚鼠血清IgE水平明顯高于對(duì)照組； 4、過敏性休克的豚鼠體內(nèi)類胰蛋白酶、胃促胰酶及IL-5的表達(dá)增強(qiáng)，可以為過敏性休克的診斷提供形態(tài)學(xué)依據(jù)； 5、按國(guó)務(wù)院頒布的《醫(yī)療事故處理?xiàng)l例》實(shí)施細(xì)則規(guī)定的死亡后冷藏48小時(shí)或冷凍7天內(nèi)進(jìn)行尸檢的條件標(biāo)準(zhǔn)，在以上兩種條件下進(jìn)行這三種介質(zhì)的免疫組織化學(xué)染色，不影響它們的表達(dá)以及對(duì)其結(jié)果的判定； 6、本實(shí)驗(yàn)類胰蛋白酶和胃促胰酶免疫組織化學(xué)染色方法有望應(yīng)用