LPS致流產(chǎn)作用及保胎中藥的調(diào)控效應(yīng)研究.pdf

1、繁殖障礙是使家畜繁殖力降低的主要原因,引起繁殖障礙的重要原因之一就是流產(chǎn)。哺乳動物尤其是反芻家畜又以妊娠早期的胚胎丟失幾率最高。流產(chǎn)不僅造成胎兒夭折和母畜產(chǎn)奶量損失,延長母畜產(chǎn)仔間隔,而且常常引起胎衣滯留,造成子宮內(nèi)膜炎,及母畜的習(xí)慣性流產(chǎn),甚至使母畜失去繁殖性能,直接影響家畜的繁殖、品種的改良,給國家和企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,已經(jīng)引起人們的高度重視。內(nèi)毒素(感染或水平上升)是造成流產(chǎn)的一個重要原因,故本研究運(yùn)用LPS建立小鼠腸道和肝臟

2、損傷、流產(chǎn)和胚胎著床障礙的三種模型,并結(jié)合體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法,探討內(nèi)毒素對肝臟的損傷機(jī)制及肝臟對內(nèi)毒素的清除,同時研究LPS誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)和著床障礙的分子機(jī)制以及保胎中藥的作用機(jī)理,為闡明LPS與妊娠母胎界面的免疫關(guān)系,尋找能夠有效預(yù)防和調(diào)控妊娠早期胚胎丟失的藥物并探索其作用機(jī)制,從而減少流產(chǎn)在動物生產(chǎn)中的發(fā)生,提高母畜的繁殖力和畜牧業(yè)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。
　　 通過對LPS致小鼠肝損傷模型進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)LPS導(dǎo)致腸道的通透性增加,腸

3、黏膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)降低,推測破壞腸黏膜機(jī)械屏障可能是LPS對腸黏膜屏障損傷的重要機(jī)制之一。同時腹腔注射LPS引起回腸ROS大量蓄積,提示ROS可能參與調(diào)節(jié)LPS引發(fā)的腸黏膜屏障損傷過程。LPS處理組小鼠血清中的ALT/AST顯著升高,說明肝細(xì)胞受損,肝功能下降。肝臟MDA含量劇增,抗氧化酶SOD、CAT、GPx活性明顯降低,意味著LPS引起肝臟ROS的大量蓄積,并引起了脂質(zhì)過氧化損傷。通過DHE熒光法檢測發(fā)

4、現(xiàn)LPS同樣能引起人肝癌細(xì)胞HepG2產(chǎn)生大量的ROS,這一點(diǎn)與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果一致。同時LPS導(dǎo)致小鼠血中有大量的NO,肝臟的TNF-α、KC的含量明顯升高,KCmRNA表達(dá)顯著升高,肝臟的iNOS蛋白和肝細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB表達(dá)上升。LPS刺激HepG2之后能使其分泌大量的IL-8,且通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)胞漿中靜態(tài)的NF-κB被激活,轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核,參與調(diào)節(jié)趨化因子IL-8(或KC)的轉(zhuǎn)錄。LPS處理24h后,血清中內(nèi)毒素水平仍明顯高于對

5、照組,說明受損的肝臟尚未能徹底清除血液中的內(nèi)毒素,另一方面腸道通透性增加有可能導(dǎo)致腸腔內(nèi)大量的內(nèi)毒素被吸收入血。
　　 對LPS誘導(dǎo)孕鼠流產(chǎn)模型研究發(fā)現(xiàn),LPS可顯著減低孕鼠的子宮重量和子宮局部的Th2型細(xì)胞因子(IL-4和IL-10)含量,升高子宮Th1型細(xì)胞因子(主要是IFN-γ,對IL-2作用不明顯)含量,使母-胎界面的Th1/Th2細(xì)胞因子平衡向著Th1方向偏移,同時誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜內(nèi)的CD4+T細(xì)胞和F4/80巨噬細(xì)胞大量

6、聚集,但基本不影響CD8+T細(xì)胞的含量。預(yù)口服保胎無憂散、泰山磐石散和白術(shù)散三種中藥方劑的水煎液能調(diào)節(jié)子宮微環(huán)境,提高子宮重量,抑制Th1型細(xì)胞因子的分泌,提高Th2型細(xì)胞因子的水平,還能顯著降低LPS引起的CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增加,同時使子宮CD8+T細(xì)胞的數(shù)量顯著增加,從而調(diào)節(jié)Th1/Th2的免疫平衡,使其向著有利于正常妊娠的方向發(fā)展,顯著降低了孕鼠的流產(chǎn)率和胚胎吸收率,并對LPS造成的子宮損傷有一定的修復(fù)作用。
　　

7、 采用孕3d小鼠腹腔注射LPS的方法成功建立胚胎著床障礙模型。研究發(fā)現(xiàn),LPS處理后,小鼠血清和子宮組織中NOS活性明顯增加,子宮中IFN-γ含量顯著上升、IL-10含量無顯著變化,且呈劑量依賴性,使Th1/Th2平衡向Th1反應(yīng)方向移動,因此改變了著床期小鼠子宮免疫微環(huán)境,導(dǎo)致了胚胎著床障礙。口服0.5mg或1mg黃芩苷或槲皮素均能明顯拮抗LPS誘導(dǎo)的著床障礙,使平均著床胚胎數(shù)顯著上升,著床率升高。黃芩苷顯著抑制LPS引起的子宮組織中

8、IFN-γ水平的上升,提高子宮IL-10的含量,降低子宮和血清的NOS活性,從而減少NO的過量合成,使其接近于正常妊娠狀態(tài)。以上結(jié)果在LPS處理的體外培養(yǎng)著床期小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞的模型中,也得到證實(shí)。此外槲皮素能通過顯著抑制LPS誘導(dǎo)的子宮IFN-γmRNA的高表達(dá),上調(diào)子宮組織中TGF-β1mRNA的表達(dá)來調(diào)節(jié)子宮局部的免疫平衡。黃芩苷和槲皮素均調(diào)節(jié)子宮局部的免疫平衡,使其向著有利于妊娠建立的Th2反應(yīng)偏移,發(fā)揮保胎促孕功效。
　

9、　 綜上,LPS通過導(dǎo)致腸道緊密連接蛋白表達(dá)降低,腸黏膜屏障受損,引發(fā)內(nèi)毒素血癥。大量的LPS刺激Kupffer細(xì)胞和肝細(xì)胞,產(chǎn)生大量ROS,抗氧化酶活性降低,激活NF-κB,產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì),加重了肝損傷,清除內(nèi)毒素的能力下降。LPS誘導(dǎo)的孕鼠流產(chǎn)和著床障礙,主要是通過破壞母胎界面的Th1/Th2免疫平衡狀態(tài);而中藥方劑和中藥成分能夠顯著拮抗LPS的破壞作用,改善和修復(fù)子宮的免疫平衡,使其有利于正常妊娠和著床,發(fā)揮其保胎促孕功效。