中藥致突變作用

1、第七章 中藥致突變作用,Genetic Toxicology,第一節(jié) 遺傳毒理學(xué)及其相關(guān)概念,突變(mutation)：生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生的可遺傳的變化(遺傳物質(zhì)發(fā)生的變化及引起的變異)。自發(fā)性突變(spontaneous mutation)：自然條件下發(fā)生的突變。誘發(fā)性突變(induced mutation)：人為地或受各種因素誘發(fā)產(chǎn)生的突變。突變是毒理學(xué)中的一種損害作用,中藥致突變劑(chemical mutagen)：能引起

2、致突變作用的中藥成分。Direct-acting mutagenIndirect-acting mutagen遺傳毒理學(xué)(genetic toxicology)：研究化學(xué)性和放射性物質(zhì)的致突變作用以及人類接觸致突變物質(zhì)可能引起的健康效應(yīng)的學(xué)科。,遺傳毒性(genetic toxicity)：對基因的損害能力。包括對基因組的毒性作用引起的致突變性及其他各種不同的效應(yīng)(如原發(fā)性DNA損傷)，包括致突變性。遺傳毒性的效應(yīng)可能轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔?/p>

3、，也可能被修復(fù)。,研究中藥致突變作用目的或內(nèi)容： 致突變的中藥及其成分 致突變作用的機(jī)制 檢測及其評價致突變健康危害的方法,第二節(jié) 中藥的致突變作用,遺傳學(xué)損傷的類型：基因突變(gene mutation)：基因中DNA序列的變化。也稱點突變(point mutatiion)，是組成一個染色體的一個或幾個基因發(fā)生變化。 不能用光學(xué)顯微鏡直接觀察，須通過生長發(fā)育、生化、形

4、態(tài)等表型改變來判斷。目前，可直接分析DNA序列。染色體畸變(chromosome abrration)：染色體結(jié)構(gòu)的改變?；蚪M突變(染色體數(shù)目改變)(genomic mutation)：是某一個或幾個染色體的結(jié)構(gòu)或染色體的數(shù)目發(fā)生變化，用光學(xué)顯微鏡可直接進(jìn)行觀察。三者本質(zhì)相同，區(qū)別是受損程度。,第三節(jié) 中藥致突變作用的機(jī)制及其后果,中藥成分作用細(xì)胞部位不同，產(chǎn)生不同的突變：誘導(dǎo)基因突變和染色體畸變的主要靶分子為DNA，

5、誘導(dǎo)基因組突變的靶部位常是有絲分裂和減數(shù)分裂的成分，如紡錘絲。,一、引起突變的DNA變化,致突變作用的基礎(chǔ)是DNA結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)的改變。DNA的損傷有多種類型。(一)、堿基損傷堿基錯配、平面大分子嵌入DNA鏈、堿基類似物取代、堿基化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞(二)DNA鏈?zhǔn)軗p二聚體的形成、DNA加合物形成、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物形成,二、引起突變的細(xì)胞分裂過程的改變,非整倍體和多倍體是由于染色體分離異常產(chǎn)生，涉及紡錘體、微管蛋白等與紡

6、錘體有關(guān)的機(jī)制：1、與微管蛋白二聚體(構(gòu)成結(jié)合紡錘體的基本成分)：如秋水仙堿2、與微管上巰基結(jié)合：如甲基汞3、已組裝好微管的破壞：如秋水仙堿、灰黃霉素等4、中心粒移動受阻：如秋水仙堿5、其他作用：如N2O,三、其他改變,1、DNA復(fù)制的高保真性：多種酶類2、修復(fù)：修復(fù)過程及其基因與酶,四、突變的后果,靶細(xì)胞的類型決定突變對人類健康的影響：體細(xì)胞：影響個體，可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)；生殖細(xì)胞：遺傳下一代孕體體細(xì)胞：新生兒的存在

7、或畸形，流產(chǎn)、死胎等(一)生殖細(xì)胞：1、對機(jī)體無影響：如無義突變2、導(dǎo)致正常人體生化組成的異常：如ABO血型，在特殊情況下，可引起嚴(yán)重后果，如輸血。3、導(dǎo)致遺傳易感性的改變4、導(dǎo)致遺傳性疾病5、致死突變：配子死亡、死胎、自發(fā)流產(chǎn),DNA損傷修復(fù)障礙,生殖細(xì)胞突變,顯性致死,隱性致死,存活突變,流產(chǎn)、死胎,出生缺陷、基因負(fù)荷,先天性疾病,,,,,,,,,,,,一種物種的群體中每一個攜帶的可遺傳給下一代的有害基

8、因的平均水平,純合子或半合子出現(xiàn)死亡,DNA損傷修復(fù)障礙,體細(xì)胞突變,良性腫瘤,細(xì)胞衰老,未分化的胚胎細(xì)胞受損,動脈硬化,未知疾病,出生缺陷(功能或結(jié)構(gòu)畸形),,,,,,,,,惡性腫瘤,已分化的胚胎細(xì)胞受損,,,,癌變,老 化,,,出生缺陷(流產(chǎn)、死胎、癌變,,,(二)體細(xì)胞突變,第四節(jié) 機(jī)體對致突變作用的影響,DNA可受到自發(fā)性化學(xué)降解、氧化、非酶甲基以及環(huán)境中化學(xué)致突變物、輻射等因素的影響，而受到損傷

9、，但遺傳物質(zhì)在所有的物種中均能世代相傳。其原因： 1)DNA執(zhí)行高度保真復(fù)制：對復(fù)制中的錯誤能及時糾正，即通過修復(fù)而達(dá)到高度保真。 2)機(jī)體有多種機(jī)制修復(fù)DNA損傷，以保護(hù)親代DNA鏈，使其免受化學(xué)毒物的作用。 機(jī)體修復(fù)機(jī)制：損傷耐受機(jī)制和修復(fù)機(jī)制,接觸化學(xué)致突變物≠致突變作用在個體之間，反應(yīng)有很大差異個體對致突變物敏感性差異的原因： 代謝酶的遺傳多態(tài)性 修復(fù)能力差異

10、 宿主因素,,細(xì)胞處理廣泛的DNA損傷有兩個過程：如果損傷是廣泛的，細(xì)胞發(fā)生凋亡；如果損傷不十分嚴(yán)重，細(xì)胞進(jìn)行多種修復(fù)，使NDA回到未損傷狀態(tài)(無錯誤修復(fù))或到一個有所改善但仍發(fā)生了改變的狀態(tài)(錯誤傾向修復(fù))。大多數(shù)修復(fù)過程的基本原則是：損傷識別，移除損傷片段，修復(fù)DNA合成和連接。,化學(xué)致突變模式：損傷-修復(fù)-突變修復(fù)功能飽和或能力不足如腫瘤發(fā)生率每年約為1% 吸煙者中患肺癌約有10%先天性(遺傳因素)

11、，即遺傳多態(tài)性后天性(生活方式)，,,,,,個體因素,突變,第五節(jié) 觀察中藥致突變作用的基本方法,致突變試驗：有200余種，常用約20種一、觀察項目的選擇 1、觀察效應(yīng)終點及類型： 遺傳學(xué)終點(genrtic endpoint)：致突變試驗的觀察終點 基因突變；染色體畸變；染色體組畸變(非整倍體) 原發(fā)性DNA損傷(DNA原始損傷)遺傳毒理學(xué)試驗是通過直接檢測遺傳學(xué)終點或檢測導(dǎo)致某一終點的DNA損傷過

12、程伴隨的現(xiàn)象，來確定中藥產(chǎn)生遺傳物質(zhì)損傷并導(dǎo)致遺傳性改變的能力。,DNA的基本特性具有普遍性，故用非人類檢測系統(tǒng)預(yù)測對人類的遺傳危害性。指示生物：病毒、細(xì)菌、霉菌、昆蟲、植物、培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞和哺乳動物沒有一種致突變試驗?zāi)芎w所有的遺傳學(xué)終點，常用一組試驗配套進(jìn)行檢測。2、成套觀察項目： 采用何種方法，根據(jù)需要 一般包括基因突變、斷裂作用、重組作用、非整倍體或多倍體測定。 受試物在其中任何一種試驗中出現(xiàn)可

13、重復(fù)的陽性結(jié)果，即可認(rèn)為是遺傳毒性。,入選遺傳毒理學(xué)成套觀察項目的原則：1)一組試驗系統(tǒng)應(yīng)包括每一類型的遺傳學(xué)終點2)配套試驗應(yīng)包括多種進(jìn)化程度不同的物種3)體內(nèi)與體外試驗結(jié)合如ICH，1997藥品遺傳毒性評價組合： 細(xì)菌基因突變； 體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變或體外小鼠淋巴瘤細(xì)胞tk試驗； 體內(nèi)嚙齒類造血細(xì)胞染色體損傷試驗,二、常用致突變試驗,基因突變試驗應(yīng)用選擇技術(shù)檢測突變選擇技術(shù)是利用只有突變的細(xì)胞

14、或微生物才能生長的實驗條件，從許多未突變細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)很少的突變細(xì)胞。利用選擇技術(shù)可以在微生物和培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞檢測正向突變和回復(fù)突變。微生物和培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞缺乏整體動物的代謝能力，在許多遺傳試驗中，需加入活化體系以檢測出間接致突變物。常用：大鼠肝細(xì)胞勻漿的微粒體上清液+緩沖液和輔助因子----S9混合物,1、細(xì)菌回復(fù)突變試驗(Ames試驗)(bacterial reverse mutation assay) 以營養(yǎng)缺陷型的突

15、變體菌株為指示生物檢測基因突變的體外試驗。 常用菌株：組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌 色氨酸營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌原理：某個調(diào)控組氨酸合成的基因發(fā)生了點位突變，喪失了合成組氨酸能力，必需依賴外源性組氨酸才能生長。突變菌株可被各種誘變因素誘導(dǎo)，回復(fù)突變?yōu)樵B(yǎng)型，在不含組氨酸的選擇培養(yǎng)基上生長成可見的菌落。如果選擇培養(yǎng)基上回變菌落數(shù)顯著超過了自發(fā)回變數(shù)，即可判斷受試物為鼠傷寒沙門菌的致突變物。,圖 Ames試驗原理,鼠傷

16、寒沙門菌原養(yǎng)型(his+),組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株(his-),正向突變,回復(fù)突變,,,受試物,,±代謝活化系統(tǒng),Ames試驗有多種菌株，組氨酸突變部位不同、方式不同，附加的基因型改變也不同，不同的菌株對不同化學(xué)致突變物的檢出能力不同。 因此：試驗中的菌株也要配套！Ames試驗根據(jù)菌株特性，可測定：堿基置換、移碼突變或兩者。ICH推薦菌株： ①TA98、②TA100、③TA1535、 ④TA153

17、7或TA97(TA97a) ⑤ TA102或E.Coli WP2uvrA、 E.Coli WP2uvrA(pKM101)我國：TA100、TA98、TA97、TA102（1983年）,Ames試驗方法： 點試驗法：一般用于預(yù)試驗 平板摻入法：標(biāo)準(zhǔn)方法 預(yù)培養(yǎng)法：提高測試的靈敏度,哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(mammalian cell gene mutation assay)基因正向突變試驗(即野生型基因失活的突變

18、)常用方法： 小鼠淋巴瘤(L5178Y)細(xì)胞胸苷激酶位點(tk)突變檢測中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、中國倉鼠肺(V79)細(xì)胞次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶位點(hgpt)突變檢測中國倉鼠卵巢細(xì)胞的AS52細(xì)胞株黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶位點(gpt)突變檢測可檢測：座位內(nèi)堿基置換、缺失、移碼、重排,附：其它的致突變試驗檢測生物,一、微生物1、大腸桿菌WP2回復(fù)致突變試驗2、酵母菌正向∕回復(fù)突變分析二、哺乳動物細(xì)胞突變試驗

19、三、昆蟲致突變試驗：黑腹果蠅性連鎖隱性致死(SLRL)試驗：雄性生殖細(xì)胞遺傳損傷分析果蠅體細(xì)胞分析四、哺乳動物致突變試驗1、生殖細(xì)胞突變試驗：小鼠特異位點測試(SLT)(生殖細(xì)胞)2、簡單串聯(lián)重復(fù)(ESTR)突變試驗3、體細(xì)胞突變試驗：小鼠體細(xì)胞皮毛斑點突變測試五、轉(zhuǎn)基因動物突變試驗,2、染色體畸變測試--微核試驗,微核(micronucleus)：染色體片段或整條染色體在細(xì)胞分裂過程中未按正常程序進(jìn)入細(xì)胞核而滯留在細(xì)

20、胞質(zhì)中的染色質(zhì)小體。微核通常作為染色體結(jié)構(gòu)損傷、染色體分離異常的標(biāo)志。微核試驗(micronucleus test，MNT)：通過觀察有微核的細(xì)胞率(‰)，用于檢測斷裂劑及非整倍體誘發(fā)劑。,微核試驗的細(xì)胞：1)植物細(xì)胞：紫露草花粉母細(xì)胞、蠶豆根尖2)哺乳類動物細(xì)胞：骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、肺細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、精子、鼻及胃粘膜上皮細(xì)胞、皮膚細(xì)胞等3)非哺乳類動物細(xì)胞：魚紅細(xì)胞、蟾蜍紅細(xì)胞常用：嚙齒類動物骨髓多染紅細(xì)胞

21、(PCE)微核試驗成紅細(xì)胞→紅細(xì)胞，主核排出→PCE →正染紅細(xì)胞(NCE)，進(jìn)入外周血。主核排出時，微核可留存胞漿中。,微核試驗的發(fā)展：1)體外微核試驗：中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL)、卵巢細(xì)胞(CHO)、成纖維細(xì)胞(V79)。易于控制和操作2)周圍血微核試驗：可用于人類觀察3)雙核細(xì)胞法：體細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入細(xì)胞松馳素B，細(xì)胞質(zhì)分裂受阻，形成雙核，僅選擇雙核細(xì)胞進(jìn)行微核計數(shù)。靈敏度提高4)免疫熒光染色法和熒光原位雜交法：靈敏度

22、、精確度提高，判斷微核來源（片段或染色體）,3、染色體畸變分析(細(xì)胞遺傳學(xué)試驗),制備細(xì)胞分裂中期染色體標(biāo)本，在光鏡下直接觀察染色體數(shù)目和形態(tài)的改變。體外染色體畸變試驗：指示細(xì)胞：CHO、CHL、V79、外周血淋巴細(xì)胞染色體異常：裂隙、斷裂、缺失、微小體、 著絲點環(huán)、無著絲點、輻射體等(耗時、技術(shù)要求嫻熟，傾向于用微核試驗代替),體內(nèi)染色體畸變試驗：嚙齒類動物骨髓細(xì)胞染色

23、體畸變試驗嚙齒類動物睪丸細(xì)胞染色體畸變試驗 精原細(xì)胞：末次染毒后一天取樣； 初級精母細(xì)胞：染毒后12-14天取樣,4、姐妹染色單體交換試驗(sister-chromatid exchange assay),原理：在DNA合成期，所有染色體均進(jìn)行復(fù)制，形成兩條姐妹染色單體。姐妹染色單體交換(SCE)可與DNA復(fù)制的斷裂和重接有關(guān)，故可間接反映DNA損傷。方法：在光學(xué)顯微鏡下，觀察經(jīng)光處理(紫外)和染色(Giemsa)后的

24、交換染色單體，計數(shù)SCE數(shù)，判斷受試物對DNA的損傷作用 結(jié)果較染色體分析枳度差,5、果蠅伴性隱性致死試驗(sex-linked recessive lethal test，SLRL),主要用于雄性生殖細(xì)胞遺傳損傷分析。利用隱性基因在伴性(性連鎖)遺傳中具有交叉遺傳特性。優(yōu)點：簡便、經(jīng)濟(jì)。特異性高，幾乎100%缺點：敏感性低，與哺乳動物差異大 陽性結(jié)果(SLRL≧5倍對照

25、)價值高發(fā)展：體細(xì)胞分析檢測遺傳變異：重組、突變、染色體缺失,6、顯性致死試驗(dominant lethal assay),顯性致死(dominant lethal)：發(fā)育中的精子或卵子細(xì)胞發(fā)生遺傳學(xué)損傷，此損傷不影響受精，但導(dǎo)致受精卵或發(fā)育中的胚胎死亡。主要由于染色體損傷(結(jié)構(gòu)或數(shù)目)。觀察終點：胚胎早期死亡檢測目標(biāo)：受試物對性細(xì)胞染色體的損傷方法：對雄性動物染毒(卵子敏感性低)，與未染毒雌性交配，觀察胚胎死亡情況。指示

26、生物：小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、果蠅等特點：實用，靈敏度差，動物數(shù)大,7、程序外DNA合成試驗(unscheduled DNA synthesis test，UDS),程序外DNA合成：正常細(xì)胞在有絲分裂過程中，僅在S期進(jìn)行DNA復(fù)制合成，當(dāng)DNA受損后，DAN的修復(fù)合成可發(fā)生在正常復(fù)制合成期(S期)以外的其他時期。方法：同步培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞阻斷于G1期，受試物處理，并加入標(biāo)記DNA合成原料(3H-胸腺嘧啶核苷)。DNA損傷，啟動修

27、復(fù)機(jī)制，標(biāo)記物摻入到DNA鏈中，通過測定摻入量，檢測修復(fù)合成，判斷受試物作用。指示生物：大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞、Hela細(xì)胞等。特點：經(jīng)濟(jì)、操作簡便、無特殊設(shè)備,8、單細(xì)胞凝膠電泳試驗(single cell gel electrophoresis，SCGE),彗星試驗(comet assay)，近年來發(fā)展的單細(xì)胞水平檢測有核細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)的方法?？蛇M(jìn)行體內(nèi)或體外試驗。方法：制細(xì)胞懸液，裂解細(xì)胞獲

28、DNA，在堿性(PH13)溶液中獲單鏈DNA，堿性條件下電泳，中和堿，顯色和彗星觀察優(yōu)點：對低水平DNA損傷敏感性高，樣品細(xì)胞數(shù)少，快速，簡便缺點：標(biāo)準(zhǔn)化、認(rèn)可度不足,9、技術(shù)進(jìn)展,1)轉(zhuǎn)基因動物致突變試驗(transgenic animal mutagenicity assay)小鼠，基因回收分析，在體組織器官分析外源與內(nèi)源靶基因反應(yīng)的一致性需進(jìn)一步證實，昂貴2)微核自動檢測技術(shù)流式細(xì)胞儀、圖像分析系統(tǒng)3)熒光原位雜交技

29、術(shù)精細(xì)結(jié)構(gòu)、非整倍體檢測準(zhǔn)確、迅速、不同細(xì)胞(期)探針不足,三、遺傳毒理學(xué)試驗的應(yīng)用和評價,1、遺傳毒理學(xué)試驗的應(yīng)用目的1)鑒定生殖細(xì)胞、體細(xì)胞致突變物2)預(yù)測潛在的致癌物3)環(huán)境遺傳毒物污染的監(jiān)測和評價根據(jù)危害鑒定、描述劑量-反應(yīng)關(guān)系、致突變機(jī)制，進(jìn)行危險度和致癌危險度評價。,2、遺傳毒理學(xué)試驗的設(shè)計1)試驗中應(yīng)設(shè)定陽性和陰性對照2)體外試驗的活化系統(tǒng)檢測直接或間接遺傳毒性①哺乳動物細(xì)胞介導(dǎo)： 無細(xì)胞

30、體系(S9)<大鼠肝原代細(xì)胞<體內(nèi)②S9系統(tǒng)：肝細(xì)胞勻漿上清液(9000g)+輔助因子(NADP、G-6-磷酸、K+∕Mg2+等)③純化酶和基因工程：純化CYP450，GSH,3、致突變試驗與致癌試驗的關(guān)系致突變試驗可鑒定潛在致癌物及揭示致癌作用機(jī)制，但存在不確定性。1)大多數(shù)致癌物具有致突變作用2)人類接觸的致癌物與DNA加合物及相關(guān)癌或抑癌基因突變有相關(guān)性3)傳統(tǒng)長期致癌試驗花費(fèi)大、周期長，難以檢出弱致癌物

31、中藥按致突變性和致癌性的分類： 遺傳毒性致癌物、非遺傳毒性致癌物、 遺傳毒性非致癌物、非遺傳毒性非致癌物遺傳毒理學(xué)試驗適用于：遺傳毒性致癌物、非遺傳毒性非致癌物可假陽性：遺傳毒性非致癌物 假陰性：非遺傳毒性致癌物 短期檢測，與其它試驗互為補(bǔ)充,4、試驗結(jié)果在毒理學(xué)安全性評價中的作用質(zhì)量控制：1)設(shè)立陰性和陽性對照2)盲法觀察(指標(biāo)觀察)3)資料的統(tǒng)計分析4)結(jié)果的重現(xiàn)性陰性結(jié)果判定

32、條件：1)最高劑量應(yīng)包括：溶解度許可、最大給藥量、最大耐受量2)組間距：不能過大陽性結(jié)果應(yīng)考慮：有量-效關(guān)系、與陰性組有顯著差異、 所觀察的遺傳學(xué)終點、試驗條件的控制,5、對人遺傳危險的評價在用遺傳毒理學(xué)試驗預(yù)測對人類危險時：1)體內(nèi)試驗的權(quán)重大于體外試驗2)真核生物試驗大于原核生物試驗3)哺乳動物試驗大于非哺乳動物試驗4)對于預(yù)測可遺傳的效應(yīng)，生殖細(xì)胞大于體細(xì)胞5

33、)各遺傳學(xué)終點的相對重要性不明確，如基因突變、染色體畸變、非整倍體大于原發(fā)性DNA損傷哺乳動物性細(xì)胞致突變性對人的遺傳危害性之間缺乏直接相關(guān)證據(jù)。遺傳流行病學(xué)研究最直接。,評價遺傳危害主要依據(jù)遺傳毒理學(xué)試驗的結(jié)果，特別是體內(nèi)生殖的致突變試驗結(jié)果；如一種化學(xué)物在多項遺傳毒理學(xué)試驗中證明有致突變性，一般假定其對人也可能有遺傳危害性具有遺傳毒性化學(xué)物的判定：任一遺傳學(xué)終點的試驗中呈現(xiàn)陽性反應(yīng)不具有遺傳毒性化學(xué)物的判定：試驗組合中的一