利用表達代謝酶的細胞系測試間接致突變物作用特征.pdf

1、微核試驗是常用的一種以染色體丟失和斷裂為遺傳學終點的細胞遺傳學方法，其常用于研究外源化學物的細胞遺傳毒性，并結(jié)合著絲粒免疫熒光標記技術(shù)分析外源化學物遺傳毒作用機制的類別。由于動物福利倫理的要求和動物試驗的“3R”原則（優(yōu)化、減少、替代），體外微核試驗逐漸成為化學物遺傳毒作用的一個重要的初篩試驗方法。體外微核試驗?zāi)壳俺Ｓ玫哪Ｐ褪侨祟惲馨图毎⒑嗽囼灪筒溉閯游锛毎滴⒑嗽囼?前者優(yōu)點是靶細胞由人類來源，后者屬永生化細胞，增殖能力強、核型穩(wěn)定

2、、試驗重現(xiàn)性佳。采用永生化哺乳動物細胞系的微核試驗的標準程序包括如下暴露/恢復時程:受試細胞短時暴露(≤0.5個細胞周期)于受試化合物，繼以較長恢復時間（≥1.5個細胞周期）;若結(jié)果為陰性或可疑陽性，則進行第二個程序的試驗;延長暴露時間（≥2個細胞周期）至細胞收獲（無恢復時間）。這樣包括兩個試驗程序的方案可最大限度減少細胞遺傳毒物漏檢（假陰性）的幾率。已有報道，第一、第二個試驗程序分別有利于檢測斷裂劑和致非整倍體劑。許多重要的環(huán)境致突變

3、物、致癌物須經(jīng)生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化后才能發(fā)揮其遺傳毒作用，所以體外微核試驗中包括添加代謝活化系統(tǒng)以彌補標準測試細胞中生物轉(zhuǎn)化酶活性缺失的試驗。經(jīng)典的外源性代謝活化體系是由酶誘導劑Aroclor1254處理的大鼠制備的肝微粒體與體外NADPH再生系統(tǒng)構(gòu)成的代謝活化體系（S9混合液），常用于化學物的體外遺傳毒性試驗中。然而，S9混合液缺乏細胞色素P450(CYP)1B1和CYP2E1以及參與大量致癌物生物活化的多種非CYP酶系，對于一些需此類

4、酶系活化的間接致突變物的檢測并不適用;S9混合液也有酶活性不穩(wěn)定和致細胞脂質(zhì)過氧化改變等缺點，所以，S9在體外微核試驗中暴露時間受限。為克服S9混合液的不足，在遺傳毒性機制研究中可使用表達人類生物轉(zhuǎn)化酶的細胞系來代替細胞外代謝活化系統(tǒng)。
　　為了印證文獻報道的斷裂劑和致非整倍體劑對染毒時程的不同選擇性。本課題先是采用已知的染色體斷裂劑（絲裂霉素C和博來霉素）和致非整倍體劑（秋水仙堿和長春花堿）對中國地鼠肺成纖維(V79)細胞染毒，

5、染毒方案分別采取以下不同暴露/恢復時程:0h/24h（陰性對照）、3h/21h、6h/18h、12h/12h、18h/6h和24h/0h，然后檢測各組微核細胞率。然而，重組表達生物轉(zhuǎn)化酶的受試細胞對間接致突變物的代謝活化是一個可能出現(xiàn)酶蛋白飽和現(xiàn)象及需要時間的過程，其是否影響暴露/恢復時程與所測試受試物微核形成機制的特定關(guān)系則尚無報道。使用共表達人CYP2E1酶和人硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT)1A1酶的重組中國地鼠肺成纖維(V79)細胞(V

6、79-hCYP2E1-hSULT1A1)來初步探討數(shù)種需生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化的外源化學物的遺傳毒作用機制。其中，1-甲基芘經(jīng)CYP2E1酶和SULT1A1酶先后兩步生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)而活化，1-羥甲基芘經(jīng)SULT1A1酶活化形成致突變物（二者未經(jīng)代謝活化均無遺傳毒性）;氫醌、兒茶酚和1，2，4-三羥基苯則被CYP2E1酶活化成活性增強的致突變物。微核試驗方法同以上第一部分，探討暴露/恢復時程對這些受試物誘發(fā)微核作用的影響，此外還分析各受試物誘導

7、細胞有絲分裂阻滯的作用（作為微管毒性的標志），為判斷受試物可能的遺傳毒作用機制（斷裂劑或致非整倍體劑）提供線索。本課題選取前期研究中以不同（遞減）強度誘發(fā)V79-hCYP2E1-hS ULT1A1細胞微核形成的4種PCB化合物（PCB20、PCB18、PCB5和PCB28），N-亞硝基二甲基胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA，依賴于CYP2E1活化的強致突變物）作為參考性已知間接致突變物探討這5種化學物誘發(fā)表達小

8、鼠CYP2E1酶的V79重組細胞(V79-mCYP2E1)和V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞Hprt基因座突變作用，比較兩個種屬CYP2E1酶代謝活化作用的選擇性和活化強度的差異，以期為相關(guān)動物試驗的物種選擇提供依據(jù)。
　　目的：
　　1.印證不同外源化學物誘發(fā)哺乳動物細胞微核形成所需敏感的暴露/恢復時程與微核形成機制（斷裂作用與致非整倍體作用）之間的關(guān)系。
　　2.研究需經(jīng)生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化的幾個外源化學

9、物在不同暴露/恢復時程條件下誘導重組表達生物轉(zhuǎn)化酶的哺乳動物細胞系微核的作用，從而明確代謝環(huán)節(jié)是否構(gòu)成對微核形成的時程毒理學的影響，以及相關(guān)間接遺傳毒物作用的可能機制。
　　3.探討人和小鼠兩個種屬的CYP2E1酶分別對NDMA和4種PCBs誘發(fā)基因突變的作用，以闡明這兩個種屬的CYP2E1對PCBs代謝活化作用的相似度或差異性。
　　方法：
　　1.細胞增殖/存活測定（CCK-8試驗）
　　2.微核試驗

10、　　3.有絲分裂細胞率的分析
　　4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(Western Blot)
　　5.Hprt基因座致突變試驗
　　6.統(tǒng)計學分析
　　結(jié)果：
　　1.斷裂劑絲裂霉素C(MMC)和博萊霉素(BLM)誘發(fā)V79細胞微核的作用隨暴露/恢復時程變化呈現(xiàn)雙相反應(yīng):首先隨著暴露時間延長微核細胞率逐漸增高，于12h/12h達到峰值，然后逐漸下降。而致非整倍體劑秋水仙素(CO

11、L)和長春花堿(VBL)誘發(fā)微核的作用則一直隨暴露時間延長而增高，于24h/0h達最高值。此外COL和VBL可誘發(fā)V79細胞有絲分裂阻滯，而MMC和BLM無此作用;與之對應(yīng)的是前二者對細胞存活/生長具有一定抑制作用，而后二者沒有明顯影響。以上結(jié)果對后續(xù)利用表達生物轉(zhuǎn)化酶細胞微核試驗染毒過程的探索提供了適當參考。
　　2.與COL和VBL對V79細胞的作用類似，1-甲基芘(1-MP)和1-羥甲基芘(1-HMP)對V79-hCYP2E

12、1-hSULT1A1細胞誘發(fā)微核的作用在暴露/恢復時程為18h/6h時達到峰值;苯的羥化代謝物對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞的作用則與斷裂劑對V79細胞的作用相似:兒茶酚(CAT)和1，2，4-三羥基苯(THB)在6h/18h時誘發(fā)微核作用最強，氫醌(HQ)作用的峰值出現(xiàn)在暴露時間稍長的時程。此外，1-MP和1-HMP對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞呈現(xiàn)一定細胞毒作用，且隨暴露時間延長而增強;相反，HQ、C

13、AT和THB則沒有明顯的細胞毒作用。并且，1-HMP和1-MP誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞明顯的有絲分裂阻滯，而CAT、THB和HQ則無明顯作用。在各暴露/恢復時程條件下，各受試物的高劑量組誘發(fā)微核和有絲分裂阻滯的作用均強于低劑量組。
　　3.蛋白印跡試驗結(jié)果顯示，V79-mCYP2E1相比于V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞中CYP2E1蛋白表達水平略低。五個受試化合物對V79細胞均未誘發(fā)基因突變;

14、然而，NDMA對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞和V79-mCYP2E1細胞均強烈誘發(fā)基因突變，且呈明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系，PCB5和PCB18可明顯誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞基因突變，但對V79-mCYP2E1細胞僅有微弱的致突變作用。PCB20和PCB28對后兩種受試細胞僅有微弱的致突變作用。
　　結(jié)論：
　　1.與既往報道相似，不同暴露/恢復時程下，斷裂劑和致非整倍體劑誘發(fā)V79細胞微核

15、的作用有明顯差異，分別于不同時程（12h/12h和24h/0h）達到其作用的峰值。結(jié)果提示在采用細胞系的體外微核試驗中，短暴露/長恢復時程可能有利于檢測斷裂劑的作用，而長暴露/短（或零）恢復則更易檢出致非整倍體劑。
　　2.根據(jù)以上斷裂劑和致非整倍體劑誘發(fā)培養(yǎng)細胞微核作用與暴露/恢復時程的關(guān)系，結(jié)合不同受試物對V79-hCYP2E1-hSULT1A1誘發(fā)微核及有絲分裂阻滯作用的差異，可認為兩個烷基化芘化合物（1-HMP和1-MP）

16、經(jīng)CYP2E1酶和/或SULT1A1酶代謝活化成為具有微管毒性及致非整倍體毒性的代謝物;而苯的羥化代謝物中，CAT和THB具有斷裂作用，HQ則可能兼有斷裂作用與致非整倍體作用。代謝活化雖有時間依賴性，但上述間接致突變物誘發(fā)微核作用的時程與直接致突變物相比并不延遲，所以細胞系微核試驗的標準程序至少對本研究采用的細胞內(nèi)代謝活化模型是適用的。
　　3.受試化合物對表達不同種屬CYP2E1的V79重組細胞致突變作用在強度和效能上的差異，特