Plumbagin通過(guò)Nrf-2的上調(diào)來(lái)抑制鼠脊髓損傷后氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)可引起難以恢復(fù)的神經(jīng)功能損害。在脊柱骨折脫位損傷中多見。脊髓損傷的病理生理過(guò)程包括兩個(gè)重要階段，第一個(gè)時(shí)間段是機(jī)械的直接損傷階段，直接的機(jī)械暴力作用于脊髓組織導(dǎo)致脊髓的不可逆性損傷，暴力瞬間完成，迅速造成脊髓組織水腫、出血、局部缺血、電解質(zhì)紊亂等病理生理變化。第二個(gè)時(shí)間段屬于繼發(fā)性損傷階段。它的影響廣泛并且深遠(yuǎn)，是由一系列的生化改變組成。其中氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性

2、反應(yīng)是脊髓損傷后繼發(fā)性破壞的兩大主要生化過(guò)程，兩者對(duì)機(jī)體細(xì)胞的毒害作用是巨大的。一般情況下直接暴力所導(dǎo)致的原發(fā)性損傷是無(wú)法避免的，很難去干預(yù)。但是對(duì)于脊髓損傷后的繼發(fā)性損害是可以做出有效的干預(yù)的。這也是目前脊髓損傷研究領(lǐng)域里的研究熱點(diǎn)。Plumbagin具有超強(qiáng)的抗氧化能力，是一個(gè)潛在的抗氧化劑。它在抗癌、抗炎、止痛方面發(fā)揮著十分重要的作用。脊髓損傷時(shí)，應(yīng)用Plumbagin是否能夠發(fā)揮其抗氧化能力，目前還沒有類似的研究報(bào)道。創(chuàng)立了一個(gè)

3、脊髓撞擊損傷的大鼠動(dòng)物模型，用來(lái)觀察Plumbagin對(duì)脊髓損傷后BBB評(píng)分、尼氏小體染色、氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物、機(jī)體內(nèi)抗氧化蛋白酶、促炎細(xì)胞因子及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的影響，以深入地明確Plumbagin在脊髓損傷繼發(fā)性損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.動(dòng)物
　　雄性威斯塔大鼠，體重在180-210g之間。由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。嚴(yán)格按照中國(guó)動(dòng)物研究協(xié)會(huì)相關(guān)規(guī)定完成實(shí)驗(yàn)流程操

4、作。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食。飼養(yǎng)動(dòng)物條件（室溫:22±1℃;12hr-12hr光/暗周期;濕度60-70％）。
　　2.大鼠脊髓損傷模型創(chuàng)立、分組及取材
　　大鼠被隨機(jī)地分成3組:1、雄性大鼠假手術(shù)組，接受假手術(shù)。2、脊髓損傷組，接受人工誘導(dǎo)的脊髓損傷，并腹腔內(nèi)打入生理鹽水。3、脊髓損傷治療組，接受人工誘導(dǎo)的脊髓損傷，并腹腔內(nèi)注射Plumbagin(20mg/kg)，損傷第一天注射一次，隨后連續(xù)注射9天。在脊髓損傷后的第1天、第3

5、天、第5天和第10天，通過(guò)BBB評(píng)分及斜板傾斜實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)各部分實(shí)驗(yàn)要求選擇Plumbagin用藥時(shí)間及相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)物處死和取材。
　　在手術(shù)之前所有的大鼠均禁飲食12h，禁水4h，整個(gè)手術(shù)過(guò)程中注意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保暖，所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，應(yīng)用10％水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉。麻醉成功后，取大鼠背側(cè)的后正中線做切口，剝離兩側(cè)的肌肉，顯露T8-T10椎板，切除椎板，注意避免損傷下方的硬膜，應(yīng)用

6、底部直徑為1.5mm，重量為10g擊錘，從2.5cm高度自由墜落，撞擊T9段的大鼠脊髓，導(dǎo)致大鼠脊髓損傷，碰擊后將重錘迅速離開。脊髓及周圍軟組織行注射抗生素處理，由內(nèi)向外逐層縫合關(guān)閉刀口。假手術(shù)組只是單一切除椎板，對(duì)大鼠的脊髓不做任何處理。大鼠脊髓損傷模型建立成功的指標(biāo):脊髓損傷的部位出現(xiàn)充血、水腫，撞擊瞬間老鼠尾巴擺動(dòng)，下肢撲動(dòng)，明顯軟癱，大鼠清醒后下肢感覺、功能障礙。術(shù)后常規(guī)皮下注射慶大霉素(12mg/kg)預(yù)防感染。保持干燥，按摩

7、促進(jìn)排尿，直至大鼠自主排尿。
　　3.Niss1小體染色
　　在第10天取材測(cè)定。將制備好的脊髓組織石蠟切片置入二甲苯中脫蠟5-10min，三次。前后經(jīng)無(wú)水乙醇、90％乙醇、70％乙醇脫水。置入蒸餾水浸泡2min。置入尼氏(Niss1)染色液染色。蒸餾水洗2遍，置入95％酒精5秒，70％的酒精洗2遍。封片處理，觀察鏡下尼氏小體情況。
　　4.損傷脊髓組織ROS測(cè)定
　　在脊髓損傷后的第1天、第3天、第5天和第10

8、天取材測(cè)定。選擇DCFH-DA做為ROS監(jiān)測(cè)的探針，在ROS存在時(shí)，DCFH被活性氧氧化為強(qiáng)綠色熒光物DCF(dichlorofluorescein)，其熒光在激發(fā)波長(zhǎng)502nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm附近有最大波峰，強(qiáng)度是跟細(xì)胞內(nèi)的ROS呈正比，反應(yīng)ROS的活性水平。本次實(shí)驗(yàn)激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm。
　　5.損傷脊髓組織TBARS測(cè)定
　　在脊髓損傷后的第1天、第3天、第5天和第10天取材測(cè)定。取損傷脊髓組織勻

9、漿，上清液留用。使用TBARS活力測(cè)定試驗(yàn)盒，按照操作手冊(cè)步驟加樣，523nm波長(zhǎng)，測(cè)定OD值，說(shuō)明書公式計(jì)算數(shù)值，結(jié)果應(yīng)用nM TBARS/mg單位表達(dá)。
　　6.損傷脊髓組織GSH測(cè)定
　　在脊髓損傷后的第1天、第3天、第5天和第10天取材測(cè)定。取損傷脊髓組織勻漿，上清液留用。按照GSH測(cè)定試劑盒說(shuō)明書步驟加樣，混均勻，靜置5min，412nm處，測(cè)量OD值。套入公式計(jì)算，結(jié)果應(yīng)用nmoles of GSH/mg表示。<

10、br>　　7.損傷脊髓組織CAT測(cè)定
　　在脊髓損傷后的第1天、第3天、第5天和第10天取材測(cè)定。取損傷脊髓組織勻漿，上清液留用。按照CAT活力測(cè)定試劑盒步驟分別加入樣本及底物后測(cè)量OD值，套入公式計(jì)算CAT活力。
　　8.損傷脊髓組織總SOD活性測(cè)定
　　在脊髓損傷后的第1天、第3天、第5天和第10天取材測(cè)定。取損傷脊髓組織勻漿，上清液留用。按照SOD活力測(cè)定試劑盒步驟加樣。37℃孵育30min，560nm測(cè)量吸光度

11、。根據(jù)公式計(jì)算SOD活力。
　　研究結(jié)果：
　　1.大鼠脊髓撞擊損傷模型建立成功
　　三組大鼠手術(shù)前的BBB評(píng)分都是21分，脊髓損傷的大鼠清醒后后肢癱瘓不能活動(dòng)，靠前肢移動(dòng)身體。組Ⅱ脊髓損傷組及組Ⅲ脊髓損傷+plumbagin治療組術(shù)后BBB評(píng)分為0級(jí)，組Ⅰ假手術(shù)組術(shù)后會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)緩慢，均在術(shù)后4-5天后恢復(fù)正常，BBB評(píng)分達(dá)到21分。
　　2.BBB評(píng)分、斜板實(shí)驗(yàn)角度改善情況及尼氏小體染色情況
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

12、發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組評(píng)分基本正常;脊髓損傷組評(píng)分明顯差于假手術(shù)組(P＜0.05);Plumbagin治療組評(píng)分明顯高于脊髓損傷組(P＜0.05)，但仍低于單純開窗組。本實(shí)驗(yàn)中假手術(shù)組爬行角度是基本正常的，但脊髓損傷組的爬行角度要明顯低于假手術(shù)組(P＜0.05)。Plumbagin治療組的爬行角度要顯著高于脊髓損傷組(P＜0.05)，但仍低于假手術(shù)組。尼氏小體染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):單純開窗組尼氏體在形態(tài)上正常，脊髓損傷組在脊髓損傷后day10可見尼氏體稀

13、疏、崩解消失，染色變淺，模糊不清，神經(jīng)元腫脹、萎縮或壞死，Plumbagin治療組在脊髓損傷后day10可見尼氏體在數(shù)量上較少外，其余皆和假手術(shù)組相似。
　　3.ROS及LP反應(yīng)程度的檢測(cè)結(jié)果
　　本實(shí)驗(yàn)探索了Plumbagin是否能夠抑制脊髓損傷組織內(nèi)ROS的表達(dá)水平及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脊髓損傷組和Plumbagin治療組在傷后Day1即可見ROS活性明顯上升，在傷后Day5達(dá)高峰，然后逐步回落，Day10時(shí)仍明

14、顯高于單純開窗組(P＜0.05)。Plumbagin治療組與脊髓損傷組相比，ROS活性在各時(shí)間分布點(diǎn)均明顯降低(P＜0.05)。脊髓組織TBA含量變化:脊髓損傷組和Plumbagin治療組的TBA含量在SCI后迅速上升，day1達(dá)高峰，其后開始下調(diào)，但Day10時(shí)仍明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。Plumbagin治療組與脊髓損傷組相比，TBA含量在各時(shí)間點(diǎn)均明顯降低。(P＜0.05)。
　　4.機(jī)體內(nèi)各抗氧化成分的檢測(cè)結(jié)果

15、r>　　二相抗氧化酶是非常關(guān)鍵的蛋白酶，它們是由Nrf-2/ARE通路進(jìn)行調(diào)度，并且在氧化應(yīng)激時(shí)對(duì)機(jī)體起著主要的保護(hù)作用。為了探討Plumbagin對(duì)脊髓損傷引起的體內(nèi)氧化成分與抗氧化成分之間的失衡所起的作用，測(cè)定了一些氧化還原酶的活性如:GSH，CAT，SOD，GSH-Px，GST及NQO1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCI后，脊髓損傷組的抗氧化酶活性明顯下調(diào)，其后逐步開始上升，但Day10時(shí)仍明顯低于假手術(shù)組(P＜0.05)。Plumbagin

16、治療組與脊柱損傷組相比，抗氧化酶的活性在各時(shí)間點(diǎn)均明顯升高(P＜0.05)。
　　5.Plumbagin對(duì)脊髓損傷引起的炎性因子的影響
　　脊髓損傷后局部的炎性物質(zhì)水平是顯著升高的。理論上Plumbagin是可以通過(guò)抑制NF-κB通路來(lái)減輕SCI后的炎性反應(yīng)的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，與假手術(shù)對(duì)照組相比，脊髓損傷組的炎性因子（TNF-α，IL-1β）的表達(dá)水平是顯著上調(diào)的。另外與單純脊髓損傷組相比，應(yīng)用Plumbagin組的炎性因子

17、（TNF-α，IL-1β）的表達(dá)水平是顯著下調(diào)的。
　　研究結(jié)論：
　　1.Plumbagin能夠改善大鼠脊髓損傷模型的后肢運(yùn)動(dòng)能力的BBB評(píng)分及斜板實(shí)驗(yàn)角度。
　　2.Plumbagin能改善大鼠脊髓損傷模型的尼氏染色病理改變。
　　3.Plumbagin可以通過(guò)降低活性氧及脂質(zhì)過(guò)氧化物來(lái)起到神經(jīng)保護(hù)作用。
　　4.Plumbagin能夠通過(guò)上調(diào)非酶氧化物GSH及其他抗氧化蛋白酶如CAT、SOD、GSH-