呼吸道合胞病毒感染誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后通過Nrf2-ARE通路調(diào)節(jié)TLR7表達(dá)的研究.pdf

1、目的:探討呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后,Toll樣受體7(Toll-like receptor7,TLR7)的水平變化,初步研究氧化應(yīng)激中Nrf2/ARE通路對TLR7活化及其主要信號分子表達(dá)的影響,探討其所介導(dǎo)的抗炎作用和可能的調(diào)控機(jī)制,為臨床治療和預(yù)防RSV感染提供新的思路。
　　方法:以RSV感染體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞,并分別給予Nrf2的抑制劑(Trigonelline,TRI)和

2、Nrf2的激動劑(Butylated hydroxyanisole,BHA)進(jìn)行處理,再以相同RSV感染,于感染后4h、8h、12h和24h不同時間點收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清,并以未感染病毒的A549細(xì)胞為正常對照組。①化學(xué)法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中活性氧指標(biāo)?OH的含量變化;②硝酸還原酶法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量的變化;③用TRIzol提取細(xì)胞中RNA,通過半定量RT-PCR法檢測TLR7、IL-6、TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化;④酶聯(lián)

3、免疫吸附法(ELISA)檢測細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α的表達(dá);⑤免疫印跡法(Western-blot)檢測實驗各組細(xì)胞中TLR7、Nrf2和HO-1的蛋白水平變化;⑥用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果:①感染組:隨著感染時間點的延長?OH和NO的含量逐漸升高;在RSV感染不同時間點,可上調(diào)TLR7、IL-6、TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá),且其表達(dá)量與感染之間有時間依賴性關(guān)系;RSV感染不同時間點,細(xì)胞上清中IL-6、TN

4、F-α的蛋白含量變化與感染之間有時間依賴性關(guān)系;細(xì)胞中TLR7、Nrf2和HO-1蛋白含量表達(dá)均與感染之間有時間依賴性關(guān)系;RS V感染組隨時間點的延長細(xì)胞抑制率增加。
　?、赥RI組:OH和NO的含量與感染組相比明顯升高;TLR7、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)比感染組相同時間點的表達(dá)量量相比明顯升高,有統(tǒng)計學(xué)意義;細(xì)胞上清中的IL-6、TNF-α的含量比感染組相同時間點的表達(dá)量明顯上調(diào),有統(tǒng)計學(xué)意義;細(xì)胞中的TLR7、Nr

5、f2、HO-1的蛋白的表達(dá)量都是上升的,但Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)雖有上調(diào),仍比感染組同時間點的低;細(xì)胞抑制率與感染組相比表達(dá)上調(diào)不明顯。
　?、跙HA組:細(xì)胞中?OH和NO的含量與感染組相比是降低的;TLR7、IL-6和TNF-α的表達(dá)雖然隨著感染時間點的延長呈現(xiàn)上升的趨勢,但與感染組同時間點的相比低;細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)與mRNA的表達(dá)一致;細(xì)胞中的TLR7、Nrf2、HO-1的蛋白的表達(dá)都呈上升的趨勢

6、,但 TLR7的蛋白表達(dá)量與感染組同時間點相比降低,而Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)比感染組相同時間點的表達(dá)量則明顯升高,且升高有統(tǒng)計學(xué)差異;細(xì)胞抑制率與感染組相比下調(diào)明顯。
　　結(jié)論:RSV感染A549細(xì)胞可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生并使TLR7及其下游分子的表達(dá)上調(diào);在加入激動劑BHA處理后,TLR7及其下游分子的表達(dá)雖然隨著感染時間點的延長也升高,但比感染組同時間點的低;在加入抑制劑Trigonelline后,TLR7及其下游分子的m