EPC抗氧化應(yīng)激通路Nrf2-ARE對鯉春病毒的響應(yīng).pdf

1、越來越多的研究表明，由病毒感染誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的組織損傷，是病毒重要的致病機制之一。而核因子E2相關(guān)因子2(Nuclearfactor-E2relatedfactor2，Nrf2)是機體在應(yīng)對氧化刺激時，啟動細胞防御體系的關(guān)鍵調(diào)控因子。由Nrf2/ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的下游效應(yīng)基因在細胞解毒，抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等方面發(fā)揮著重要作用;同時，也可能影響病毒的入侵、復(fù)制、組裝、釋放等過程。因此，有必要深入探討Nrf2與病毒的相互作用

2、，以便為病毒性疾病的預(yù)防和治療提供新的解決策略。
　　本研究以黑頭軟口鰷上皮瘤細胞（EpitheliomaPapulosumCyprini，EPC）為實驗材料，克隆得到黑頭軟口鰷（Pimephalespromelas）Nrf2基因的全長cDNA。以此為基礎(chǔ)，在細胞水平上，探討了鯉春病毒血癥病毒(SVCV)感染對核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2轉(zhuǎn)錄和表達的影響以及Nrf2的激活對SVCV復(fù)制水平的影響。主要結(jié)論如下:
　　1.黑頭軟口鰷Nr

3、f2基因cDNA的克隆及系統(tǒng)進化分析
　　利用反轉(zhuǎn)錄-PCR及3'/5'-RACE技術(shù)從EPC細胞中克隆得到了黑頭軟口鰷Nrf2基因的cDNA。該cDNA全長2115bp，其中，3'端非編碼區(qū)為159bp，并含有一個PolyA加尾信號(AATAAA)，5'端非編碼區(qū)為183bp。開放閱讀框ORF共1773bp，編碼590AA。功能預(yù)測顯示，Nrf2含有一個CNC-bZip特征序列（AA441-AA552）。氨基酸序列比對分析表明，

4、黑頭軟口鰷Nrf2與哺乳動物、鳥類及其他魚類的Nrf2基因同源。與魚類的同源性較高(52.5％-82.1％)，且與斑馬魚的同源性最高，為82.1％;而與人、鼠、原雞的同源性相對較低，分別為46.7％、45.9％，46.3％。
　　2.SVCV感染對Nrf2表達的影響研究
　　利用Real-timePCR及Westernblot技術(shù)，在細胞水平上分析了SVCV感染對Nrf2表達策略的影響。結(jié)果顯示，Nrf2的基因轉(zhuǎn)錄水平逐漸增

5、加，并在感染后12h達到峰值，隨后略微下降，但仍高于未感染組。而Nrf2的核蛋白和總蛋白含量，在感染初期3-6h內(nèi)，有明顯的提升，并且隨著感染的進行，表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢;同時，在感染后期，仍維持較高水平的蛋白表達量。上述結(jié)果表明，SVCV感染能激活Nrf2，增加其基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，導(dǎo)致Nrf2在細胞核內(nèi)的累積。
　　3.Nrf2的激活對SVCV感染的影響研究
　　用MTT法測定了兩種常用激活劑CDDO-Me、SFN對EP

6、C細胞的LD50(48h)分別為2.5μM、22μM。在此基礎(chǔ)上，通過Real-timePCR及Westernblot技術(shù)，在細胞水平上驗證了激活劑對Nrf2的激活效應(yīng)。結(jié)果表明，CDDO-Me對EPC中Nrf2的激活效應(yīng)有限。10μM的SFN能顯著性增加Nrf2的核轉(zhuǎn)運，上調(diào)Nrf2/ARE通路下游效應(yīng)基因的表達，提高EPC的總抗氧化能力。但SFN介導(dǎo)的Nrf2激活對SVCV病毒的復(fù)制無顯著性影響，盡管其G基因的相對轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)下降趨