呼吸道合胞病毒感染人肺上皮細胞誘導氧化應激對TLR3表達的影響.pdf

1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)為副粘病毒科肺炎病毒屬,是有包膜非節(jié)段性的單負鏈RNA病毒,也是引起世界范圍內(nèi)嬰幼兒嚴重下呼吸道感染的最常見病原體,并與后來的哮喘發(fā)生發(fā)展和肺功能異常有關(guān)。RSV感染可通過氧化應激(oxidative stress)造成機體的損傷,引起機體的一些病理生理變化,從而引起一些疾病的發(fā)生;如RSV感染呼吸道上皮細胞后,誘導細胞產(chǎn)生大量細胞因子、趨化因子、活性氧等生

2、物活性介質(zhì),導致嬰幼兒毛細支氣管炎、肺炎、哮喘等疾病的發(fā)生。目前國內(nèi)氧化應激研究主要集中在病毒與氧化應激的關(guān)系、對患者體內(nèi)氧化應激狀態(tài)的認識上,而對氧化應激所介導的Toll樣受體的研究相對較少。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)為I型跨膜蛋白,是識別病原體的重要受體,它們識別細菌、病毒或環(huán)境中的配體,啟動天然免疫反應和調(diào)節(jié)獲得性免疫反應。TLR3介導的信號轉(zhuǎn)導通路參與激活呼吸道上皮細胞,分泌大量炎癥免疫相

3、關(guān)細胞因子,在RSV感染引起肺炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本文通過探討RSV感染A549細胞誘導氧化應激產(chǎn)生并給予抗氧化劑和氧化促進劑進行處理,初步研究RSV感染時誘導氧化應激影響TLR3水平及其主要信號分子的表達變化,為研究RSV的致病進行有效預防和控制等提供新的思路和理論依據(jù)。
　　目的:探討RSV感染人肺上皮細胞(A549細胞)誘導氧化應激產(chǎn)生后,Toll樣受體3(Toll-like receptor 3,TLR3)的水

4、平變化,初步研究氧化應激對TLR3活化及其主要信號分子的影響。研究該調(diào)節(jié)途徑可能為RSV感染的致病機理、對所致疾病的有效預防和治療等提供新的思路和重要的研究基礎(chǔ),有重要的現(xiàn)實意義。
　　方法:以RSV感染體外培養(yǎng)的A549細胞,并分別給予氧化劑和抗氧化劑進行處理,再以相同RSV感染,于感染后4h、8h、12h和24h不同時間點收集細胞和細胞培養(yǎng)上清,并以未感染病毒的A549細胞為正常對照組。①用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PC

5、R)檢測不同組別TLR3、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κ-binding,NF-κB)p65、干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)mRNA的表達量變化;②用WST-1法檢測SOD活力;③硝酸還原酶法檢測細胞培養(yǎng)上清中一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量;④化學法檢測細胞培養(yǎng)上清中活性氧

6、指標羥自由基(hydroxy radical,OH·)的水平。
　　結(jié)果:①在mRNA轉(zhuǎn)錄水平,在RSV感染不同時間點上調(diào)TLR3、NF-κB基因轉(zhuǎn)錄水平表達,下調(diào)IRF-3、SOD基因轉(zhuǎn)錄水平表達,而且其表達量與感染之間有時間依賴性關(guān)系;在加入抗氧化劑NAC后,TLR3、NF-κB的表達雖有上調(diào),但表達量都比感染組同時間點下降,IRF-3、SOD的mRNA比感染組相同時間點的表達量下調(diào)不明顯。在加入氧化劑H2O2后,TLR3、N

7、F-κB的mRNA表達比感染組相同時間點的表達量明顯升高,且升高有差異性,IRF-3、SOD的mRNA比感染組相同時間點的表達量下調(diào)更明顯,且降低有差異性。②WST-1法檢測SOD:RSV感染組隨時間點的延長SOD活力逐漸下降,給予抗氧化劑NAC處理后,SOD活力與感染組相比下調(diào)不明顯;給予氧化劑H2O2處理后,SOD與感染組相比表達明顯下調(diào);③硝酸還原酶法檢測細胞培養(yǎng)上清NO的含量:RSV感染組NO含量逐漸升高,在給予抗氧化劑NAC處

8、理后NO含量與感染組同一時間點相比降低;給予氧化劑H2O2處理后,NO的含量與感染組相比明顯升高;④化學法檢測細胞培養(yǎng)上清中活性氧指標OH·含量:在RSV感染組,隨著感染時間點的延長OH·的含量逐漸升高,在給予抗氧化劑NAC后,OH·的含量與感染組相比是降低的;給予氧化劑H2O2處理后,OH·的含量與感染組相比明顯升高。以上結(jié)果表明NAC和H2O2分別起到了抑制和激動氧化應激的作用,從而影響了TLR3轉(zhuǎn)錄水平的表達情況,進一步影響了下游

9、的一些主要炎性因子變化。
　　結(jié)論:RSV感染A549細胞可誘導氧化應激的產(chǎn)生,在感染組,RSV感染可使TLR3表達上調(diào);在加入抗氧化劑NAC后,再行相同RSV感染,雖上調(diào)TLR3的表達,但表達量比感染組相同時間點的下降;在加入氧化劑H2O2后,再行相同RSV感染,TLR3的mRNA表達比感染組相同時間點表達量明顯升高。用氧化劑和抗氧化劑處理后,TLR3及其下游主要信號分子的表達出現(xiàn)明顯的變化,表明呼吸道合胞病毒感染活化TLR3的