呼吸道合胞病毒感染對(duì)大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性的影響.pdf

1、目的：在研究RSV感染后氣道神經(jīng)源性炎癥和氣道神經(jīng)可塑性致氣道高反應(yīng)性的基礎(chǔ)上，研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染后大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化，篩選可能與氣道神經(jīng)可塑性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步從細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制深入探討氣道神經(jīng)可塑性的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控機(jī)制，闡明氣道神經(jīng)可塑性導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和哮喘的機(jī)理，為哮喘的防治探索一條新的途徑。 方法：RSV病毒株接種于鋪滿單層Hela細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待病變達(dá)100％時(shí)

2、收獲病毒。-70℃保存?zhèn)溆?。收集無病毒的Hela單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基上清液和細(xì)胞溶解產(chǎn)物，從而獲得病毒基質(zhì)作為陰性對(duì)照。進(jìn)行感染性(50％組織細(xì)胞發(fā)生病變的感染劑量即TCID50/0.1ML)的測(cè)定(毒力測(cè)定)。1-2周齡SD大鼠(湖南省農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物部)隨機(jī)區(qū)組分為2組，每組30只.1組：空白對(duì)照組；2組:RSV感染組①對(duì)照組(30只)，用2％戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，每一個(gè)鼻孔內(nèi)滴入0.4ul/g無病毒培養(yǎng)基。②RS

3、V感染組(30只)，用2％戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，在每一個(gè)鼻孔內(nèi)滴入0.4ul/g滴度為5X104TCID50/0.1ML的RSV病毒懸液。以上操作每周重復(fù)一次。兩組第8周按編號(hào)后抽簽方法將其中5只大鼠進(jìn)行氣道反應(yīng)性測(cè)定，氣道反應(yīng)性測(cè)定后，取左肺，HE染色觀察病理改變，行免疫組化染色檢測(cè)，在冰面上迅速剖取脊髓背根神經(jīng)節(jié)C7-T5于凍存管中，保存于液氮中。原位雜交法檢測(cè)肺組織RSV蛋白的存在，免疫組化檢測(cè)氣道、神經(jīng)節(jié)SY

4、N、NF的表達(dá)，用轉(zhuǎn)錄因子活性芯片初步篩選調(diào)控氣道神經(jīng)可塑性的信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子,western blot檢測(cè)EGR-1在肺組織和脊髓背根節(jié)的表達(dá)變化。 結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)組大鼠漸出現(xiàn)卡他性鼻炎、呼吸氣促、毛亂、活動(dòng)度降低的臨床表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組大鼠在平均體重差異無顯著性，體溫差異有顯著性(P<0.05)。(2)實(shí)驗(yàn)組大鼠吸入梯度濃度組胺后氣道阻力明顯高于正常對(duì)照組，差異有顯著性(均P<0.05)，說明存在氣道高反應(yīng)性。(3)光鏡

5、下實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織符合典型間質(zhì)性肺炎的病理改變。(4)實(shí)驗(yàn)組氣道壁、神經(jīng)節(jié)中SYN、NF蛋白表達(dá)平均陽(yáng)性系數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。(5)利用TranSignal蛋白/DNA組合芯片(345)檢測(cè)篩選：RSV反復(fù)感染引起大鼠C7-T5背根節(jié)345個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中的55個(gè)表達(dá)上調(diào)2倍以上，43個(gè)表達(dá)下調(diào)2倍以上。(6)western blot檢測(cè)EGR-1在肺部和脊髓背根節(jié)細(xì)胞的表達(dá)變化，結(jié)果顯示EGR-1在RSV感染組表達(dá)明顯低于對(duì)