核小體在DNA降解過(guò)程中的作用及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究.pdf

1、目的:高度降解DNA的分型問(wèn)題一直是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的難點(diǎn)。大規(guī)模災(zāi)難性事件、命案現(xiàn)場(chǎng)、恐怖襲擊后的個(gè)人識(shí)別工作，多涉及高度腐敗降解檢材的檢測(cè)與分析。高溫、潮濕、紫外輻射、土壤微生物、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等因素都會(huì)使檢材中的DNA分子被損壞，從而發(fā)生斷裂，分子變小，大片段丟失，堿基缺失，堿基修飾，因此減少了生物檢材中完整的目標(biāo)片段含量，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增不良，甚至擴(kuò)增失敗或目標(biāo)基因座錯(cuò)誤分型。本研究從構(gòu)成染色質(zhì)DNA的固有性質(zhì)出發(fā)尋找檢測(cè)降解檢材的突破

2、口，使用IlluminaHiseq2000 Genome Analyser分析平臺(tái)獲得人類白細(xì)胞核小體定位信息和核小體核心區(qū)域遺傳標(biāo)記信息。通過(guò)比較核小體核心DNA區(qū)與非核小體核心DNA區(qū)內(nèi)遺傳標(biāo)記在降解DNA中的差別，來(lái)探討核小體對(duì)降解DNA的檢驗(yàn)影響，以期在確定其有抗降解性的前提下，開(kāi)發(fā)更利于降解檢材分析的核小體遺傳標(biāo)記體系。從而為降解DNA的檢驗(yàn)提供全新的技術(shù)手段及發(fā)展方向。
　　方法:1.從健康人外周血收集白細(xì)胞，使用微球

3、菌核酸酶進(jìn)行消化提取核小體核心區(qū)DNA。使用Illumina Hiseq2000 Genome Analyser分析平臺(tái)對(duì)獲得的核小體核心區(qū)DNA進(jìn)行測(cè)序，獲得數(shù)據(jù)產(chǎn)出總量，測(cè)序覆蓋度等測(cè)序數(shù)據(jù)概況。對(duì)獲得的DNA測(cè)序數(shù)據(jù)中SNPs、Indels、STRs這三種遺傳標(biāo)記的分布情況進(jìn)行分析，篩選出位于核心區(qū)與非核心區(qū)內(nèi)的遺傳標(biāo)記;
　　2.對(duì)篩選出的位于核小體核心DNA區(qū)域內(nèi)的法醫(yī)學(xué)常用STRs，以相同數(shù)目的非核心DNA區(qū)域內(nèi)法醫(yī)學(xué)

4、常用STRs為對(duì)照，通過(guò)進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物使擴(kuò)增片段長(zhǎng)度小于147bp，使用實(shí)時(shí)熒光定量的方法和毛細(xì)管凝膠電泳分析技術(shù)對(duì)人工降解檢材和實(shí)際案件檢材進(jìn)行分析，比較核小體不同區(qū)域內(nèi)法醫(yī)學(xué)常用遺傳標(biāo)記的抗降解性差異。
　　3.對(duì)第一部分獲得的未經(jīng)報(bào)道的核小體STR候選基因座進(jìn)行群體遺傳學(xué)調(diào)查和法醫(yī)學(xué)參數(shù)評(píng)價(jià)，將最終篩選的具有法醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力的未經(jīng)報(bào)道的核小體STR基因座與第二部驗(yàn)證的具有良好抗降解性的核小體法醫(yī)學(xué)常用STR基因座，一并構(gòu)建核小

5、體STR復(fù)合擴(kuò)增體系。比較該體系與MiniFilerTM試劑盒在降解檢材檢測(cè)中的差異，同時(shí)將核小體STR復(fù)合擴(kuò)增體系與MiniFilerTM試劑盒中各基因座測(cè)序所獲核小體定位信息與核小體軟件(NuScore軟件)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，進(jìn)一步分析測(cè)序?qū)τ讷@得準(zhǔn)確核小體遺傳標(biāo)記的重要性。
　　結(jié)果:1.第一部分結(jié)果:①測(cè)序所獲數(shù)據(jù)概況:成功提取了人類血液白細(xì)胞內(nèi)核小體核心DNA并進(jìn)行了Solexa高通量測(cè)序，總共獲得reads數(shù)目為17，

6、752，5592×100雙末端reads，讀長(zhǎng)為101bp。其中可比對(duì)到基因組唯一位置reads數(shù)目為26，750，300，占可比對(duì)數(shù)目的75.34％。實(shí)驗(yàn)所獲reads的平均GC含量為52％，平均基因組覆蓋率約為34％(1042463676/3095693983)，其中22號(hào)染色體覆蓋率最低，為27％;X染色體覆蓋率最高，可達(dá)52％。測(cè)序深度可達(dá)3×。通過(guò)測(cè)序reads與參考基因組(human genome，hg19)比對(duì)所獲read

7、s中大多數(shù)分布在intergenic和intronic區(qū)域內(nèi)，分別達(dá)到了52.5％和38.8％。②所獲測(cè)序reads中核小體遺傳標(biāo)記概況:本研究共篩選到至少有10條reads支持的單核苷酸變異(single nucleotide variations，SNVs)共2462個(gè)，至少有10條reads支持的插入缺失位點(diǎn)（Insertion-deletion polymorphisms，indels）128個(gè)，其中大部分遺傳標(biāo)記位于inter

8、genic區(qū)域。在檢測(cè)到的2462個(gè)SNVs中有2220個(gè)SNVs在dbSNP_138數(shù)據(jù)庫(kù)中存在記錄，242個(gè)SNVs為該樣本特有，不存在于dbSNP_138數(shù)據(jù)庫(kù)中。在檢測(cè)到的128個(gè)indels中有89個(gè)indels在dbSNP_138數(shù)據(jù)庫(kù)中存在記錄，39個(gè)indels為該樣本特有，不存在于dbSNP_138數(shù)據(jù)庫(kù)中。使用兩種方法對(duì)所獲reads中STRs進(jìn)行篩選。將獲得的reads中的STR與法醫(yī)學(xué)常用的44個(gè)STRs進(jìn)行比對(duì)

9、。共有5個(gè)STRs被篩選到，即TH01、TPOX、D18S51、DYS391和D10S1248。通過(guò)編寫程序進(jìn)行STR的分析。從兩個(gè)角度進(jìn)行了編程篩選。編程方法1側(cè)重于篩選所得STR位于核小體線性定位的中心部分;編程方法2側(cè)重于篩選所得STR位于測(cè)序深度較高的reads部分。當(dāng)滿足編程篩選方法1全部條件時(shí)共篩選到10167個(gè)STRs;當(dāng)滿足編程篩選方法2的前4個(gè)條件時(shí)篩選到295126個(gè)STRs，當(dāng)滿足全部5個(gè)條件時(shí)可見(jiàn)有468種重復(fù)序

10、列入選。兩種方法均包括使用方法一篩選到的5個(gè)法醫(yī)學(xué)常用STRs即TH01、TPOX、D18S51、DYS391和D10S1248。
　　2.第二部分結(jié)果:①選擇第一部分篩選的5個(gè)核小體法醫(yī)學(xué)常用STRs（D10S1248、D18S51、TH01、TPOX和DYS391）和5個(gè)非核小體法醫(yī)學(xué)常用STRs（CSF1PO、 D5S818、D8S1179、D16S539和DYS392）進(jìn)行抗降解性比較。②Mann-Whitney U Te

11、st分析顯示兩組擴(kuò)增子片段長(zhǎng)度無(wú)差異。③實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示伴隨著DNaseⅠ消化時(shí)間的增加，在5例人工降解檢材中各基因座的含量均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。重復(fù)測(cè)量方差分析和多元方差分析對(duì)各時(shí)間點(diǎn)核小體組STRs和非核小體組STRs基因座含量分析結(jié)果顯示在5min、10min、20min時(shí)，被分析的5例人工降解檢材中核小體組STRs與非核小體組STRs均存在差異。④毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)果顯示在20例人工降解檢材中，經(jīng)Mann-Whitney U

12、Test分析核小體組STRs基因座檢出率明顯高于與非核小體組STRs(P=0.001＜0.05)。在20例人工降解檢材中，核小體組STRs基因座平均檢出率為64.75％，非核小體組STRs基因座平均檢出率為26.75％。在被分析的10個(gè)STRs中，位于核小體組的D10S1248基因座更容易被毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)到（在20例人工降解檢材中該基因座檢出率達(dá)到了100％）。D18S51基因座是核小體組內(nèi)檢出率最低的一個(gè)基因座，其檢出率低于60％

13、。非核小體組內(nèi)基因座檢出率普遍較低，達(dá)到了10％至45％之間。在12例福爾馬林固定樣本中，核小體組檢出率明顯高于非核小體組(P=0.008＜0.05)。核小體組基因座平均檢出率為50％;非核小體組的平均檢出率為27％。在核小體組中隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)檢出率有明顯下降的趨勢(shì)，非核小體組隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)檢出率基本無(wú)變化，但不論固定時(shí)間長(zhǎng)短，核小體組檢出率均明顯高于非核小體組。在被分析的5個(gè)核小體組STRs中，4個(gè)STRs基因座(TPOX、T

14、H01、D10S1248、DYS391)檢出率較高，可以作為第三部分復(fù)合擴(kuò)增體系構(gòu)建的候選基因。
　　3.第三部分結(jié)果:①篩選到2個(gè)具有法醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力的未經(jīng)報(bào)道的核小體STR基因座（AC012568.7和AC007160.3），兩個(gè)基因座在河北漢族人群中的雜合度觀察值分別是0.648和0.722，多態(tài)信息含量分別是0.52和0.59，個(gè)人識(shí)別能力分別為0.755和0.787，非父排除力為0.353和0.463。②成功構(gòu)建了5個(gè)包含

15、核小體STRs(TPOX，TH01，D10S1248，AC012568.7和AC007160.3)的核小體復(fù)合擴(kuò)增體系。③結(jié)果顯示MiniFilerTM(＜147bp)組各基因座核小體形成潛力高于核小體復(fù)合體系中各基因座。結(jié)果提示較軟件預(yù)測(cè)方法，大規(guī)模測(cè)序技術(shù)篩選核小體核心區(qū)域遺傳標(biāo)記更為準(zhǔn)確，更貼近法醫(yī)學(xué)實(shí)踐需求。
　　結(jié)論:1.本研究應(yīng)用新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)人類血液白細(xì)胞核小體核心DNA進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選出位

16、于核小體核心區(qū)域的SNVs共2462個(gè)，Indels128個(gè)，STRs10167（編程篩選方法1）和295126個(gè)（編程篩選方法2），其中包括5個(gè)法醫(yī)學(xué)常用STRs(TH01，TPOX，D18S51,DYS391和D10S1248)。
　　2.該5個(gè)法醫(yī)學(xué)常用核小體STR基因座對(duì)DNase消化的降解DNA及福爾馬林固的降解檢材的檢出成功率明顯高于非核小體STR基因座，說(shuō)明核小體對(duì)DNA的確具有保護(hù)作用，是用于高度降解檢材DNA檢驗(yàn)

17、的優(yōu)選遺傳標(biāo)記。
　　3.最后，本研究成功構(gòu)建了包括5個(gè)核小體STRs(TPOX、TH01、D10S1248、AC007160.3和AC012568.7)的復(fù)合分型體系，該復(fù)合分型體系無(wú)論對(duì)人工降解DNA還是福爾馬林固定檢材，均具有較高的檢出率，明顯高于MiniFilerTM試劑盒。提示利用核小體這種保護(hù)作用研發(fā)核小體STR分型體系，可以為解決高度降解DNA分型難題提供了新思路和新策略。
　　4.通過(guò)比較大規(guī)模測(cè)序篩選結(jié)果與