全基因組擴(kuò)增方法的建立及其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用.pdf

1、研究背景與目的 在法醫(yī)學(xué)檢案實(shí)踐中，常遇到樣本DNA含量極其有限，以致DNA分型無(wú)法完成或不能滿足重復(fù)檢測(cè)的需要。因此，對(duì)微量模板DNA分析便成為法醫(yī)學(xué)DNA檢驗(yàn)的一個(gè)難題。以PCR-STR為代表的遺傳標(biāo)記分析技術(shù)雖然一定程度上解決了法醫(yī)學(xué)微量檢材的難題，但一些檢材仍因DNA含量極其有限而無(wú)法檢測(cè)成功,或僅檢出少數(shù)基因座而無(wú)法使累計(jì)鑒別能力達(dá)到認(rèn)定水平。這類(lèi)檢材被稱(chēng)為痕量DNA，也稱(chēng)低拷貝模板(low copy number，L

2、CN)，Gill等將其定義為低于100pg的模板DNA。為解決這一難題，有研究用增加PCR循環(huán)數(shù)，但模板DNA量太低時(shí)易產(chǎn)生等位基因丟失或非特異帶，且循環(huán)數(shù)增加到一定程度后再增加循環(huán)數(shù)也不會(huì)顯著增加靈敏度；另外，有人試圖用巢式PCR，但巢式PCR技術(shù)僅限于單一位點(diǎn)分析，無(wú)法提高目前法醫(yī)學(xué)中常規(guī)DNA檢測(cè)所用的多位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增所需的模板數(shù)量。全基因組擴(kuò)增(Whole Genome Amplification，WGA)是一種能從有限的DNA樣

3、品獲得充足的DNA量供后續(xù)分析的技術(shù)，其基本思路是通過(guò)對(duì)微量組織甚至單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA擴(kuò)增，大幅度增加DNA的總量。因此被認(rèn)為是目前可以解決上述難題的一種有效方法。 WGA技術(shù)經(jīng)10余年探索，在方法上已逐步發(fā)展和不斷完善起來(lái)，已被廣泛用于疾病基因研究等領(lǐng)域，并取得了良好的效果。但在法醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用很少。在目前常用的幾種WGA方法中，改良擴(kuò)增前引物延伸方法(Improved primer extension preampl

4、ification，IPEP)和多重置換擴(kuò)增方法(Multiple displacement amplification，MDA)對(duì)STR基因座分型顯示出較好的效果。故本研究探討了這兩種方法用于法醫(yī)學(xué)微量檢材的效果，包括對(duì)其靈敏度、擴(kuò)增忠實(shí)性、能否用于法醫(yī)學(xué)常用STR基因座及常用檢材等進(jìn)行系統(tǒng)性研究，從而對(duì)其用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐的可行性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并建立穩(wěn)定可行的技術(shù)方案。 方法 1.對(duì)30例口腔拭子樣品，采用酚-氯仿法提取DN

5、A，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量，并分別稀釋成1ng、0.5ng、0.1ng、0.05ng、0.025ng、0.01ng六種模板量DNA，然后進(jìn)行MDA反應(yīng)和IPEP反應(yīng)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)MDA方法和IPEP方法的產(chǎn)物濃度，比較兩種方法的擴(kuò)增效率。分別以MDA產(chǎn)物和IPEP產(chǎn)物為模板DNA，用AmpFLSTR@Identifiler@試劑盒擴(kuò)增，ABl3100基因分型儀檢測(cè)基因型，比較MDA產(chǎn)物和IPEP產(chǎn)物用于STR分型的

6、效果。 2.對(duì)IPEP方法反應(yīng)體系的成分和終濃度進(jìn)一步優(yōu)化，建立改良IPEP方法，并檢測(cè)其擴(kuò)增效率和STR分型效果。將改良IPEP方法用于30例血液、30例血紗、30例精液等三類(lèi)法醫(yī)學(xué)常見(jiàn)生物檢材進(jìn)行檢測(cè)，觀察改良IPEP方法的可重復(fù)性和對(duì)法醫(yī)學(xué)常見(jiàn)生物檢材的適用性。 3.將改良IPEP方法用于20例汗?jié)撝赣　?0例一次性牙刷、20例自然脫落頭發(fā)等三種法醫(yī)學(xué)常見(jiàn)疑難微量檢材的模擬案例，觀察改良IPEP方法對(duì)上述檢材的ST

7、R分型效果；用于現(xiàn)場(chǎng)果核10例、礦泉水瓶10例、煙蒂10例、衣領(lǐng)10例等實(shí)際案例，觀察改良IPEP方法的實(shí)際案件檢驗(yàn)?zāi)芰Α?結(jié)果 1.MDA法產(chǎn)量為5.15ug～19.75ug，可對(duì)模板DNA增加5.15x103～1.98x106倍：IPEP法產(chǎn)量為0.5ng～66ng，可對(duì)模板DNA增加25～310倍。MDA法產(chǎn)物濃度高于IPEP法，差異有顯著性意義(F=3643.433,P<0.001)。 2.常規(guī)檢測(cè)法、M

8、DA法、IPEP法的基因座檢出數(shù)有顯著性差異(F=1033.297,P<0.001.)。當(dāng)DNA模板量為1ng時(shí)，常規(guī)檢測(cè)方法、MDA方法、IPEP方法均可獲得復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)所有基因座的準(zhǔn)確分型結(jié)果：當(dāng)DNA模板量為0.5ng時(shí)，常規(guī)檢測(cè)方法和IPEP方法均獲得所有基因座的準(zhǔn)確分型結(jié)果，MDA方法獲得10個(gè)以上基因座的準(zhǔn)確分型結(jié)果：當(dāng)DNA模板量為0.1ng～0.01ng時(shí)，MDA方法基因座檢出數(shù)高于常規(guī)檢測(cè)方法，IPEP方法基因座檢出數(shù)

9、高于MDA方法。 3.DNA模板量≥1ng，其MDA產(chǎn)物雜合子基因座的等位基因擴(kuò)增均衡；DNA模板量≤0.5ng，其MDA產(chǎn)物的STR分型圖譜可見(jiàn)等位基因不平衡或丟失現(xiàn)象，且模板DNA量越低，等位基因不平衡或丟失現(xiàn)象越明顯。DNA模板量≥0.05ng，其IPEP產(chǎn)物雜合子基因座的等位基因擴(kuò)增均衡；DNA模板量≤0.025ng，其IPEP產(chǎn)物的STR分型圖譜可見(jiàn)等位基因不平衡或丟失。MDA產(chǎn)物和IPEP產(chǎn)物用于STR分型時(shí)均未觀察