MtDNA SNPs復合檢測體系建立及法醫(yī)學應用研究.pdf

1、生物性檢材易受外來環(huán)境等因素干擾,一直是困擾法醫(yī)生物痕跡學專家們的難點問題,如腐敗組織、陳舊骨骼等,因檢材的降解,使DNA序列的完整性受到破壞,影響鑒定結(jié)論的得出。目前國內(nèi)外法醫(yī)學實驗室應用最為廣泛的STR檢測系統(tǒng),通常適用于常規(guī)檢材,但對微量DNA檢材、降解檢材、無核檢材等則常常因等位基因丟失、非特異性擴增、或擴增不出檢測片段,導致檢測失敗,至今法醫(yī)生物痕跡學(法醫(yī)物證)領(lǐng)域尚未完全解決這一難題。
　　 人類線粒體DNA(mi

2、tochondrial DNA,mtDNA)是位于細胞核以外的唯一基因組DNA,主要遵循母系遺傳,母親和子女、兄弟姐妹之間的mtDNA在理論上是一致的,個體唯一的mtDNA不存在。mtDNA是由一萬六千多個堿基對組成的環(huán)狀閉合共價雙鏈分子,外有被膜包圍,這樣的特性使其在外界環(huán)境中不易受到核酸外切酶的影響。每個細胞核DNA只有兩個拷貝,而每個細胞的mtDNA有成千上萬個拷貝,突變率是核DNA的5～10倍,但在外界環(huán)境中更易保存下來,擴增時

3、拷貝數(shù)更高,對于考古、大型災難調(diào)查、親緣關(guān)系認定、核DNA分型失敗的法醫(yī)學檢材等,mtDNA遺傳標記具有良好的應用前景。
　　 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是由基因組水平上的單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性,其中最少的一種在群體中的頻率不少于1％,具有在基因組分布廣泛、遺傳穩(wěn)定、分析易于自動化等特點。它包括了人類基因組已知多態(tài)性的80％,是最常見的遺傳變異類型。

4、從生物遺傳和變異的本質(zhì)分析,SNPs將是一種最能反映群體遺傳結(jié)構(gòu)和個體間遺傳差異的標記系統(tǒng)。由于具有分析片段更小(45-150bp)、遺傳穩(wěn)定,以及可實現(xiàn)高通量、自動化檢測等特點,SNPs已經(jīng)成為法醫(yī)學解決高度腐敗檢材DNA分型以及其他領(lǐng)域的研究的熱點。在法醫(yī)學應用SNPs的主要目的是進行大量SNPs位點的同步檢測,累計多個SNPs位點的分型結(jié)果,認定同一性或親權(quán)關(guān)系,從而在個體識別和親權(quán)鑒定中發(fā)揮作用。
　　 由于mtDNA具

5、有突變率高、母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組、進化速度快等特性,很多研究主要是集中在mtDNA疾病、表觀遺傳學等方面。目前國內(nèi)外對線粒體SNPs這一熱點領(lǐng)域已經(jīng)有了很多研究,但大多數(shù)針對人類進化、基因突變和表達、藥物代謝動力學、表觀遺傳學、腫瘤學和其他疾病如Parkinson's disease、Alzheimer's disease、肥胖、糖尿病等方面進行研究,進行高通量的研究比較少。雖然也有在法醫(yī)學應用方面的研究,但還沒有針對中國人群已經(jīng)建

6、立的復合高效檢測遺傳標記體系的研究。本課題利用復合PCR擴增、熒光標記單堿基延伸(SBE)技術(shù)和毛細電泳檢測相結(jié)合的方法,建立一個多位點的mtDNA SNPs復合檢測體系,實現(xiàn)對多個mtDNA SNPs位點同步快速擴增,建立的體系特異性好、靈敏度高、操作簡單、準確性高,為微量、降解檢材和無核檢材的高通量分型提供了新的技術(shù)手段和方法,并通過廣東地區(qū)人群的群體遺傳學調(diào)查,探討其在法醫(yī)學案件中的應用價值。
　　 根據(jù)NCBI的dbSN

7、Ps數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/dbSnp)、核酸數(shù)據(jù)庫查找到rCRS(修正劍橋參考序列,Revised Cambridge ReferenceSequence),從mitoMAP數(shù)據(jù)庫(A human mitochondrial genome database)、mtDB數(shù)據(jù)庫(Human Mitochondrial Genome Database)報道在亞洲人群中多態(tài)性較好、側(cè)翼序列穩(wěn)

8、定的mtDNA SNPs位點和部分從未用于亞洲人群檢測位點,其選擇目的在于研究在中國人群是否存在多態(tài)性,其選擇的位點包括8392、5178、8414、10211、14470、13626、15217、709、1719、15607、13928、7028、10398、10400、6392、9090、5843、2092、16519、4833、5250、12438、4529、4580、11719、477、4793、11914、12633、1285

9、8、10873、13263、7202。
　　 根據(jù)上述位點進行普通PCR引物設(shè)計和單個SNPs位點的PCR擴增,利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(nPAGE)和銀染技術(shù)對單位點PCR擴增產(chǎn)物進行檢測驗證。其后通過“加尾”設(shè)計不同長度的單堿基延伸引物(單堿基引物的長度為18-88nt,每個位點只設(shè)計一條引物),利用SNaPshotTM Multiplex Kit試劑盒對每個位點進行單堿基延伸反應及毛細管電泳檢測,確定各個位點的遷移距離

10、。通過正交法對復合PCR體系中各組分及PCR反應的循環(huán)參數(shù)進行調(diào)整,去除無法進行復合PCR擴增的位點如2092、6392、9090、5843,引物間二聚體形成的位點如8392,無法用復合單堿基延伸方法檢測的位點如10400、8414、5178、10211,有非特異性擴增位點如13626、15217、14470,考慮引物間的相互作用和擴增效率,在保證體系的高多態(tài)性的情況下,綜合考慮了引物間的相互作用、體系穩(wěn)定性和擴增檢測效率,最終選定了2

11、1個mtDNA SNPs位點,建立復合檢測體系。
　　 最后使用建立的體系對236名廣東地區(qū)無關(guān)個體、30個三聯(lián)體家系進行調(diào)查,并對實際檢案中收集的部分微量、腐敗降解檢材進行檢測分型,評估該體系在法醫(yī)學中的應用價值,最終獲得了21個mtDNA SNPs位點的頻率分布資料,除位點12438、477外,其余19個遺傳標記位點在廣東地區(qū)人群中均具有遺傳多態(tài)性。去除12438、477兩個位點,最終建立19個mtDNA-SNPs復合檢測體

12、系,其基因多樣性(gene diversity)GD范圍為0.0085-0.4980,共檢測到90種單倍型(haplotype),單倍型多樣性(haplotype diversity)HD為0.9705。
　　 在建立的10μl PCR復合擴增體系中,最低檢測量為50pg,當模板量在0.1～10ng時,能得到較理想結(jié)果。檢測10種動物血樣,猴、牛、豬、鵝、鼠、兔、雞、羊、狗、貓的DNA樣本均無特異性擴增產(chǎn)物。本課題研究中同一個體

13、的肌肉、皮膚、肝臟、脾臟、毛發(fā)、指甲、軟骨、血痕和骨骼等組織基因分型沒有差異性。
　　 本體系采用檢測30例家系(外祖母-母-子/女)、20對兄弟和姐妹、5個同一母系來源的表姐妹,未發(fā)現(xiàn)有突變,個體分型結(jié)果一致。
　　 對實際檢案中收集的部分微量、腐敗檢材進行檢測分型,對于50例STR僅檢出1～5個基因座的檢材,本體系能夠成功完成18個mtDNA SNPs以上位點的分型。
　　 結(jié)論:本課題研究建立了一個以單堿基

14、延伸和毛細管電泳熒光檢測技術(shù)為基礎(chǔ)的19-plex mtDNA SNPs復合檢測體系,包括709、1719、15607、13928、7028、10398、16519、4833、5250、4529、4580、7202、11719、4793、11914、12633、12858、10873、13263。該體系在中國廣東地區(qū)漢族人群中具有多態(tài)性,遺傳穩(wěn)定性好、種屬特異性強。所建立的19個mtDNA SNPs復合檢測體系靈敏度高、通量大、重復性好