胰腺干細(xì)胞的原位傳代擴(kuò)增培養(yǎng)方法及體內(nèi)移植的初步探討.pdf

1、目的：優(yōu)化并穩(wěn)定胰腺干細(xì)胞體外培養(yǎng)條件；比較不同成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層對胰腺干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的效果，探索建立一種能夠獲得數(shù)量較多、富集度較高的胰腺干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法；進(jìn)行昆明小鼠體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)，檢測胰腺干細(xì)胞體內(nèi)存活情況。
　　 方法：取新生SPF級昆明小鼠的胰腺組織，使用Ⅳ型膠原酶消化，細(xì)胞懸液培養(yǎng)和組織塊培養(yǎng)，前兩天用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，以后改換無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特征及生長特性，通

2、過免疫細(xì)胞化學(xué)染色等技術(shù)和方法，檢測胰腺干細(xì)胞特異性標(biāo)志-Nestin，對胰腺干細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定。采用原位傳代擴(kuò)增培養(yǎng)的方法獲得富集度高的胰腺干細(xì)胞。將擴(kuò)增的第二代胰腺干細(xì)胞行DAPI和Brdu標(biāo)記后注入昆明小鼠腿部肌肉及側(cè)腦室，于不同時間點(diǎn)通過免疫組織化學(xué)的方法觀察其自然存活情況。
　　 結(jié)果：體外培養(yǎng)24h，出現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞，其密度不斷增大，組織塊培養(yǎng)1w，細(xì)胞懸液培養(yǎng)3～4d后胰腺成纖維細(xì)胞密度達(dá)到70％～80％時，此

3、時胰腺干細(xì)胞逐漸出現(xiàn)，具有活躍的分裂增殖能力，表達(dá)特異性標(biāo)志-巢蛋白(Nestin)。胰腺干細(xì)胞可進(jìn)行多次原位傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，富集度提高、保持未分化狀態(tài)和旺盛的分裂增殖能力。對擴(kuò)增后的第二代胰腺干細(xì)胞行DAPI標(biāo)記后注入昆明小鼠腿部肌肉，一周后未檢測到存活的胰腺干細(xì)胞，Brdu標(biāo)記后的胰腺干細(xì)胞注入小鼠側(cè)腦室后3d，檢測到存活的胰腺干細(xì)胞，1w時逐漸減少，2w時未檢測到標(biāo)記后的胰腺干細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 (1)原位傳