臍血干細胞移植體內(nèi)誘導分化為肝細胞的實驗研究.pdf

1、目的通過臍血干細胞移植在體內(nèi)誘導分化為肝細胞的實驗研究，進一步為臍血干細胞向肝細胞的分化提供證據(jù)，證實臍血干細胞的可塑性，為將臍血干細胞移植應用于治療終末期肝病的研究奠定基礎。 方法①使用采血袋法采集臍血標本，分別采用改良HES(羥乙基淀粉)沉降分離法和Ficoll分離法兩種方法分離臍血干細胞，比較分離前后有核細胞(nuclearcell，NC)數(shù)、分離后CD34+細胞數(shù)、分離后有核細胞回收率及臺盼藍拒染率，了解分離后有核細胞的

2、數(shù)量和質(zhì)量，為臍血移植創(chuàng)造條件。 ②選用BALB/C裸鼠，將其隨機分成實驗組和對照組，實驗組再根據(jù)輸注有核細胞數(shù)的不同分成A、B、C三組。采用Co60治療儀γ-射線對實驗組和對照組進行亞致死劑量350cGy照射，照射后3小時內(nèi)在無菌條件下由裸鼠尾靜脈輸入分離的人新鮮臍血有核細胞。實驗A、B、C三組分別輸入NC1.0×107個/只、2.0×107個/只、3.0×107個/只，對照組經(jīng)尾靜脈注入等體積無菌生理鹽水。移植后第1、2、3

3、、4和8周分別檢測實驗組和對照組外周血白細胞，移植后第4、6和8周通過流式細胞儀檢測外周血人源性CD34+和CD45+細胞水平，了解人鼠細胞嵌合情況。移植后一個月對實驗組A、B和對照組裸鼠分別按0.4ml/kg注射用玉米油稀釋到100μl的四氯化碳(carbontetrachloride，CCl4)，實驗組C注射等體積生理鹽水。通過CCl4造成肝臟損傷，誘導臍血干細胞歸巢到肝臟，分化為肝細胞，建立臍血移植體內(nèi)分化肝細胞的人鼠嵌合模型。臍

4、血移植后2個月(CCl4注射后1個月)經(jīng)免疫組化和RT-PCR檢測鼠肝，了解人源性CK18、CK19和人源性白蛋白(ALB)的表達。 結(jié)果1、臍血采集和有核細胞的分離。收集臍血10份，臍血量65～124ml，平均87ml。經(jīng)比較，改良HES(羥乙基淀粉)沉降分離法和Ficoll分離法分離前的臍血量、有核細胞密度和細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，分離后改良HES法有核細胞數(shù)、CD34+細胞數(shù)、有核細胞回收率(為臍血分離后的

5、有核細胞數(shù)與分離前的有核細胞數(shù)之百分比)高于Ficoll分離法(P＜0.05)；而顯示有核細胞活力的臺盼藍拒染率兩種方法差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。兩種方法細菌培養(yǎng)均為陰性。 2、臍血干細胞移植后的觀測①裸鼠生存情況。實驗組裸鼠無死亡，對照組在Co60γ射線照射后死亡4只，CCl4注射后死亡3只。 ②白細胞數(shù)變化情況。測量時間的不同及不同組注入臍血有核細胞數(shù)的不同對代表造血功能的WBC數(shù)的差異有影響(F=722.1

6、46，P=0.000)。臍血移植前及移植后第8周實驗組各組與對照組之間WBC數(shù)差異不明顯(P＞0.05)；移植后第1、2、3、4周實驗組各組與對照組之間WBC數(shù)不全相同(P＜0.05)。各時間點WBC水平與移植前相比，移植后實驗組各組與對照組WBC均下降，第1周WBC數(shù)最低，但隨時間的延長WBC逐漸增加，到第4周實驗組各組WBC已恢復至移植前水平，而對照組WBC水平仍較低(P=0.000)，第8周已恢復正常。 ③外周血中的huC

7、D34+細胞和huCD45+細胞在4周時均已出現(xiàn)，但總體水平較低。實驗組A、B、C三組同一組不同時段人源性CD34+、CD45+細胞數(shù)不完全相同(F=43.181，P=0.000；F=67.08，P=0.000)；同一時段不同組CD34+、CD45+細胞數(shù)也不完全相同(F=10.351，P=0.002；F=186.26，P=0.000)。實驗組A的huCD34+和huCD45+細胞數(shù)水平各個時段均較實驗組B和實驗組C低(P＜0.05)；

8、而實驗組B和實驗組C的huCD34+和huCD45+細胞數(shù)水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CD34+、CD45+細胞在第4周時相關關系明顯，r=0.9034，P=0.000；第6、8周相關系數(shù)無統(tǒng)計學意義(分別為r=0.2128，P=0.465；r=0.25，P=0.393)。也許和樣本含量較少有關。 ④GVHD。臍血移植組裸鼠處死后，經(jīng)病理檢查，肝、皮，小腸等部位均無明顯改變。 ⑤AFP、CK18、CK19和AL

9、B的表達。通過免疫組化對對照組裸鼠和臍血移植后未經(jīng)CCl4處理的實驗組裸鼠肝組織行AFP、CK18、CK19和ALB檢測未見陽性的黃染著色細胞。而在臍血移植后經(jīng)CCl4處理的實驗組裸鼠肝組織行CK18、CK19和ALB免疫組化檢測見胞漿內(nèi)呈棕黃色顆粒的細胞呈片狀、簇狀、灶性分布。圖像分析結(jié)果顯示，實驗組BCK18、CK19、ALB的特異性表達強度均高于實驗組A(P＜0.05)；而在同一實驗組中CK18、CK19、ALB三者之間的表達強度

10、差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。AFP則未見表達。通過RT-PCR對CCl4處理的移植組裸鼠的肝組織行人源性CK18、CK19和ALB的mRNA擴增后可見特異性陽性條帶，而未經(jīng)CCl4處理的實驗組裸鼠和對照組裸鼠肝組織卻未能擴增出特異性條帶。圖像分析結(jié)果顯示，實驗組BCK18、CK19、ALB的特異性表達強度均高于實驗組A(P＜0.05)；而在同一實驗組中CK18、CK19、ALB的表達其差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明在臍血移

11、植后經(jīng)CCl4處理裸鼠的肝臟中有人源性成熟肝細胞和小膽管上皮細胞的存在。 結(jié)論1、用改良HES分離臍血獲取造血干/祖細胞的數(shù)量和質(zhì)量均高，而且操作簡單方便、分離速度快、污染機會小、終體積小，在臍血移植的研究和臨床應用方面可推廣改良HES分離法的使用。 2、BALB/C裸鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，免疫反應弱，是異種移植嵌合體模型研究的較為理想的實驗動物。 3、臍血干細胞植入體內(nèi)能形成人鼠細胞嵌合體，且GVHD發(fā)生率低，