成體大鼠胰腺干細(xì)胞的獲取、定向分化及體內(nèi)移植的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 探討大鼠成體胰腺干細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)的實驗條件，了解其定向分化潛能。將分化后的終末細(xì)胞移植于糖尿病大鼠模型腹腔內(nèi)，觀察其胰島素分泌和血糖變化，評價對糖尿病的治療效果。
　　 方法：
　　 V型膠原酶原位灌注成年Wistar大鼠胰管，消化胰腺組織。濾網(wǎng)濾過，收集濾過液，F(xiàn)icol1400濃度梯度離心法分離胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞的體外培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，根據(jù)干細(xì)胞貼壁生長的特點，倒掉培養(yǎng)液、去除懸浮胰

2、島和其它混雜細(xì)胞。運用細(xì)胞免疫熒光染色法，對傳代后的細(xì)胞進(jìn)行CK19、Pdx-1、Nestin、Insulin和Glucagon基因抗原鑒定，然后在高糖培養(yǎng)基及肝細(xì)胞生長因子、尼克酰胺等共刺激下，誘導(dǎo)體外定向分化。對誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行雙硫腙染色，并采用伊蘭氏染色光電酶標(biāo)記法檢測胰島素分泌功能。應(yīng)用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射法，誘導(dǎo)建立Wistar大鼠糖尿病模型，連續(xù)2次測量尾靜脈血，隨機血糖大于16.7mmol/l為建模成功。將4

3、0只建模成功的糖尿病大鼠隨機分為A、B2組，每組20只，A組為接受胰島細(xì)胞移植治療組（實驗組）；B組為安慰劑注射組（對照組）。分別于移植前1天、移植后1周、2周、3周、4周，經(jīng)尾靜脈采血測量血清胰島素和血糖水平。將得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，得出結(jié)論。
　　 結(jié)果：
　　 采用V型膠原酶原位灌注消化法，可將大鼠胰腺組織充分均勻消化為細(xì)沙粒狀，通過Ficoll400液濃度梯度離心法，將充分消化后的胰腺組織細(xì)胞清晰分層。取胰腺

4、干細(xì)胞層（中上層）細(xì)胞，在體外環(huán)境下可穩(wěn)定傳代培養(yǎng)8代。通過細(xì)胞免疫熒光法鑒定干細(xì)胞表面CK19、Pdx-1和Nestin基因抗原均呈陽性，陽性細(xì)胞率分別為（88.6±6.2）％、（84.6±8.6）％和（81.3±7.5）％，而Insulin及Glucagon染色對照為陰性。體外誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞經(jīng)雙硫腙染色，可見棕紅色細(xì)胞團(tuán)，胰島素分泌功能測定為陽性。腹腔一次性注射65mg/kg體重的鏈脲佐菌素（STZ），可以有效的誘導(dǎo)大鼠高血糖模型

5、，高血糖狀態(tài)可穩(wěn)定至少一個月。移植后血清胰島素水平測定： A組平均為9.30±1.56MU/L，B組為11.41±1.52MU/L；血糖水平測定：A組平均為8.22±2.7mmol/L，B組為12.23±3.8 mmol/L。在SPSS13.0統(tǒng)計軟件上分別對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量數(shù)據(jù)的一元方差分析，F(xiàn)血糖=5.232，P血糖<0.05；F胰島素=3.274，P胰島素<0.05，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 采用