GFP轉基因骨髓間充質干細胞的定向誘導分化及腦內移植的實驗研究.pdf

1、帕金森病是老年人常見的神經退行性疾病,其病理學基礎為中腦黑質向紋狀體投射的多巴胺能神經元進行性退變,造成腦內多巴胺含量減少,從而引起震顫、肌張力增高及運動障礙等一系列臨床表現。目前多采用藥物治療,但不能根治該病的發(fā)展。
　　 細胞移植治療帕金森病的實驗研究已開展多年,有的采用胚胎中腦細胞或腎上腺髓質細胞移植,雖有一定的療效,但不持久,因為是細胞存活時間不長。而干細胞移植可針對性地補充退變的多巴胺能神經元,是治療帕金森病的理想方法

2、,但一直難以找到合適的細胞來源。近年來發(fā)現神經干細胞可以增殖并分化為多巴胺能神經元,是理論上合適的供體細胞,但是胚胎神經干細胞的取材存在倫理學上的問題,成體神經干細胞含量少且不易取材,這些都限制了神經干細胞在治療神經退行性病變中的應用。
　　 骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的未分化細胞,可以分化為三個胚層來源的細胞,在特定誘導條

3、件下,BMSCs可分化為神經細胞,尤其是分化為多巴胺能神經元,用于移植治療帕金森病可避免法律和倫理學上的麻煩,這些優(yōu)點使得BMSCs成為細胞移植的新的供體來源。但是目前尚無有效方法將BMSCs誘導分化為多巴胺能神經元。
　　 紋狀體是中腦黑質多巴胺能神經元投射的靶組織,在胚胎發(fā)育過程中,中腦神經元軸突逐漸投射到紋狀體,在紋狀體組織微環(huán)境的誘導下,這些神經元分化為功能明確的多巴胺能神經元。研究表明,紋狀體內含有多種神經營養(yǎng)因子和神

4、經誘導因子,對中腦多巴胺能神經元的生長和發(fā)育起重要作用。本實驗室曾經用紋狀體提取液或紋狀體組織塊將胚胎干細胞及神經干細胞成功誘導分化為多巴胺能神經元。鑒于上述思考,本研究設計以下實驗檢測紋狀體組織微環(huán)境對BMSCs的定向誘導分化作用。在體外實驗中,制備了紋狀體提取液檢測其對BMSCs的誘導作用；在體內實驗中,將BMSCs移植到腦紋狀體內,觀察在體紋狀體組織微環(huán)境對BMSCs的定向誘導分化作用。
　　 眾所周知,普通的BMSCs移

5、植到鼠腦后,由于無法區(qū)分供體細胞和受體組織而難以準確檢測到BMSCs的分化及分布情況。為了識別移植細胞,在以往的移植實驗中多采用二苯甲酰胺(Bis benzamide,BBZ)或5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)來標記細胞。但研究表明BBZ和Brdu可能會擴散進入供體細胞,且隨著細胞分裂標記物會逐漸稀釋,難以準確示蹤。為了準確示蹤及分析BMSCs的體內存活和分化情況,我們從GFP(green

6、fluorescentprotein)轉基因鼠取材了BMSCs,即GFP-BMSCs。GFP轉基因鼠來源的BMSCs的GFP基因會隨著細胞分裂、增殖傳遞到子代細胞中,在細胞中穩(wěn)定表達,且終生存在。標記細胞在熒光顯微鏡下可直接檢測到,易于追蹤移植BMSCs在腦內的存活、分化與遷移情況。
　　 本實驗用取自GFP轉基因鼠的BMSCs,進行了體內和體外定向誘導分化的實驗研究。在體外實驗中,采用全骨髓細胞接種貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)GFP-BMS

7、Cs,并應用流式細胞術檢測傳代細胞CD29、CD11b的表達情況進行細胞鑒定:制備紋狀體提取液,將紋狀體提取液加入GFP-BMSCs的培養(yǎng)基中作為實驗組,觀察細胞生長及分化情況,正常培養(yǎng)的GFP-BMSCs作為對照組。應用流式細胞術檢測紋狀體提取液對GFP-BMSCs的細胞周期的影響,行免疫細胞化學染色技術檢測GFP-BMSCs表達神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、膠質纖維酸性蛋白(glia

8、l fibrillary acidic protein,GFAP)及酪氨酸羥化酶(tyrosinehydmxylase,TH)的情況,以檢測其分化狀況。
　　 在體內實驗中,將GFP-BMSCs通過立體定位儀植入大鼠腦紋狀體,分別在移植術后的1d、7d、14d、28d及45d灌注取腦,經過固定沉糖后做冰凍切片,觀察GFP-BMSCs在腦內的存活與分布情況,并采用免疫組織化學染色技術檢測移植細胞分化為神經元、神經膠質細胞及多巴胺能

9、神經元的情況。
　　 結果顯示,體外培養(yǎng)的GFP-BMSCs在熒光顯微鏡下呈現綠色,傳代培養(yǎng)的細胞呈現均一的長梭形并排列成梳狀、細胞密集處呈現旋渦狀或團狀等骨髓間充質干細胞典型的形態(tài)特征。流式細胞術顯示取材的細胞表達CD29,而基本不表達CD11b,顯示細胞純度較高。細胞生長曲線顯示第3代BMSCs具有良好的增殖能力。加入紋狀體提取液后細胞生長良好,部分細胞長出突起,呈現神經細胞樣。流式細胞術分析顯示紋狀體提取液可促進GFP-B

10、MSCs從G0／G1期向S期轉化,即促進細胞DNA復制和蛋白質的合成。免疫細胞化學染色結果顯示,實驗組培養(yǎng)細胞可檢測到NSE、GFAP及‘TH的表達,其中NSE陽性率為37.00±4.29％,GFAP陽性率為14.56±2.49％,TH陽性率為15.00±3.83％；對照組細胞NSE陽性率為2.30±0.77％,未檢測到GFAP和TH的表達。實驗組與對照組結果比較具有統計學意義(三種染色結果分析均p<0.01.),即紋狀體提取液能誘導G

11、FP-BMSCs向神經細胞方向分化,尤其是多巴胺能神經元。
　　 體內實驗結果顯示,GFP-BMSCs移植到腦紋狀體后存活良好,可觀察到明顯的移植區(qū)。隨著移植時間的延長,部分GFP-BMSCs從移植區(qū)遷移至紋狀體,并分化為NSE、GFAP和TH陽性細胞,表明移植細胞可分化為神經元及神經膠質細胞并能在紋狀體內分化為多巴胺能神經元。細胞移植后大部分分布于紋狀體,也有少量的移植細胞可見于皮層、側腦室和胼胝體等處。
　　 綜上所