生物工程材料介導(dǎo)的成體干細(xì)胞移植治療大鼠腦損傷修復(fù)的實驗研究.pdf

1、外傷性腦損傷是全球性的多發(fā)性傷病,也是死亡率和致殘率最高的傷病之一,并且會造成嚴(yán)重的家庭和社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。促進(jìn)顱腦損傷后神經(jīng)修復(fù)與再生是當(dāng)前研究的熱點和難點。
　　 腦的自我修復(fù)能力有限,存在于腦組織中的內(nèi)源性干/祖細(xì)胞對損傷的應(yīng)答,產(chǎn)生新的有功能的細(xì)胞能力有限,而且受損的中樞內(nèi)微環(huán)境也不適合神經(jīng)組織的再生,因此治療腦損傷的策略在于改善損傷局部的微環(huán)境,使其適于神經(jīng)組織的修復(fù),同時移植入外源性細(xì)胞替代失去功能或死亡的細(xì)胞,并與宿主

2、細(xì)胞形成具有功能的整合,改善神經(jīng)行為缺陷。
　　 受損傷腦組織的功能重建與局部血管網(wǎng)的重建、改善新陳代謝環(huán)境也關(guān)系密切。目前認(rèn)為,成體新血管的形成過程是血管生成和血管發(fā)生兩個過程的復(fù)合,血管生成是毛細(xì)血管從膨大的小血管側(cè)長出的過程；而血管發(fā)生是通過血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelia progenitor cell,EPCs)原位形成血管。當(dāng)腦組織受損缺失時,組織空洞中移植入的神經(jīng)干細(xì)胞在沒有血管形成的情況下,僅依賴損傷周邊區(qū)域

3、的血管生成,無法得到生存所需的充足養(yǎng)分,如果有EPCs作為血管發(fā)生的原基而原位形成血管、則會大大有利于受損傷腦組織的結(jié)構(gòu)與功能修復(fù)。當(dāng)前的大部分腦損傷干細(xì)胞移植研究都缺乏對此問題的考慮,也由此導(dǎo)致移植入的細(xì)胞生存率很低。本實驗擬通過移植入EPCs,結(jié)合生物工程材料的方式,促進(jìn)腦損傷的組織空洞中血管網(wǎng)的重建。移植入的EPCs將充當(dāng)新血管形成的底物,并且運用旁分泌的方式促進(jìn)血管生成。
　　 神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cel

4、ls,NSCs)具有自我增殖和分化能力,能夠分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞等,可以用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后移植替代失去功能或死亡的細(xì)胞,移植入的細(xì)胞分化的神經(jīng)元能與宿主細(xì)胞形成具有功能的整合,改善和恢復(fù)缺失的神經(jīng)功能,移植入的細(xì)胞分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)改善損傷局部的微環(huán)境,并且為移植入的神經(jīng)元和損傷局部遷移再生的神經(jīng)元提供物理支撐,使其適于神經(jīng)組織的修復(fù),而移植入的細(xì)胞分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞可能參與損傷局部的免疫

5、反應(yīng)。
　　 目前生物工程材料已經(jīng)廣泛使用在皮膚、骨骼、軟骨、血管、外周神經(jīng)及脊髓等組織缺損的再造和修復(fù)。組織工程策略目的在于提供種子細(xì)胞粘附的支架。本課題擬采用的生物工程水凝膠材料為移植物的基質(zhì)材料,其優(yōu)勢在于可注射性,便于移植操作,自動塑性,適應(yīng)性強,適用范圍廣。
　　 本實驗擬在采用控制性腦皮質(zhì)撞擊(controlled cortical impact,CCI)制作標(biāo)準(zhǔn)化的中度腦損傷模型的基礎(chǔ)上,應(yīng)用成體來源NSC

6、s、EPCs聯(lián)合生物工程水凝膠材料進(jìn)行腦損傷空腔內(nèi)移植,以期能夠替代損傷缺失的腦組織細(xì)胞,并且建立新的功能聯(lián)系,恢復(fù)受損的神經(jīng)功能。
　　 目的:獲取并體外擴(kuò)增成年大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)、脂肪來源干細(xì)胞(adipose tissue derived stem cells,ADSCs),并分別向神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)及血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(e

7、ndothclial progenitorcells,EPCs)方向誘導(dǎo)分化,分別檢測其表型及功能,對比不同來源細(xì)胞的差異。
　　 方法:取大鼠股骨、脛骨骨髓,密度梯度法分離獲取BMSCs。取大鼠腰部白色脂肪組織,Ⅰ型膠原酶消化法獲取血管基質(zhì)片,運用“DMEM/F12+10％胎牛血清(FBS)”擴(kuò)增ADSCs。運用堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)和N2等誘導(dǎo)成NSCs,運用“低糖DMEM培養(yǎng)液+10-8mo

8、l/L地塞米松+5％FBS+20ng/mL,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)+5ng/mL bFGF+5ng/mL胰島素樣生長因子(IGF)”配方的分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)成EPCs。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、NSCs、EPCs的表面特征抗原。細(xì)胞計數(shù)檢測細(xì)胞增殖能力。通過乙?；兔芏戎鞍?Ac-LDL)攝取和墨汁吞噬試驗、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA表達(dá)檢測、

9、體外血管生成實驗等細(xì)胞功能方面檢測進(jìn)一步確認(rèn)誘導(dǎo)出的EPCs是否具有生理功能。
　　 結(jié)果:體外可成功擴(kuò)增大鼠成體來源BMSCs和ADSCs,細(xì)胞呈長梭形,以ADSCs胞體更長,細(xì)胞排列更具方向性。BMSCs和ADSCs均能成功誘導(dǎo)出Nestin陽性的NSCs,并且在適當(dāng)培養(yǎng)條件可以進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為GFAP、Neun陽性細(xì)胞。通過本實驗設(shè)計誘導(dǎo)方案可成功將BMSCs和ADSCs誘導(dǎo)為EPCs,細(xì)胞表型CD34-、CD133+、血

10、管假性血友病因子(vWF)+和Flk-1+,并且兩種來源的EPCs增殖能力無差異。兩種細(xì)胞來源的EPCs均能攝取Ac-LDL而不吞噬墨汁,eNOS的表達(dá)也與成熟的內(nèi)皮細(xì)胞無差異,并且具有體外血管生成能力。
　　 結(jié)論:MSCs能夠分離自大鼠成體骨髓和脂肪組織。它們均具有較強增殖能力并且能夠被誘導(dǎo)分化為NSCs和EPCs。誘導(dǎo)得到的EPCs是具有生理功能的細(xì)胞。
　　 目的:體外檢測培養(yǎng)細(xì)胞與生物工程水凝膠材料的相互影響,

11、為體外培養(yǎng)細(xì)胞與生物工程水凝膠共移植治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:選擇兩款不同組分的水凝膠Matrigel和PuraMatrix作為實驗材料,以前述方法獲得的EPCs作為檢測細(xì)胞,將EPCs培養(yǎng)于不同濃度的Matrigel(10％、20％、30％)或PuraMatrix(0.25％、0.5％、1％)表面,或與不同濃度的Matrigel或PuraMatrix混懸培養(yǎng),于培養(yǎng)的不同時間觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài),并用Alamar Blue

12、法檢測細(xì)胞的增殖情況,以確定材料的細(xì)胞毒性。觀察EPCs在水凝膠中的成管化狀態(tài),以檢測細(xì)胞是否仍具有生理功能。將前述方法獲得的NSCs與最佳濃度的水凝膠共培養(yǎng)觀察細(xì)胞的生長情況,用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測其分化情況。
　　 結(jié)果:三種濃度Matrigel中30％的Matrigel細(xì)胞毒性較大,而三種濃度的PuraMatrix中1％的PuraMatrix細(xì)胞毒性較大。EPCs培養(yǎng)于Matrigel表面較混懸其中的細(xì)胞增殖率高,而且此差異

13、隨Matrigel的濃度增高而增強。EPCs在20％和30％的Matrigel表面培養(yǎng)均能成管化,在10％的Matrigel表面和混懸其中培養(yǎng)7天,多數(shù)細(xì)胞沉底。20％的Matrigel中培養(yǎng)7天能夠立體成管化。而30％的Matrigel中,EPCs僅能伸出少數(shù)突起,不能成管化。PuraMatrix在0.25％和0.5％的濃度時,EPCs培養(yǎng)于PuraMatrix表面與細(xì)胞混懸其中的細(xì)胞增殖率相比無明顯差異；而在1％時EPCs培養(yǎng)于Pu

14、raMatrix表面和混懸其中存活率均很低。EPCs在0.25％和0.5％的PuraMatrix表面培養(yǎng),細(xì)胞能夠穿入PuraMatrix中。而在0.25％的PuraMatrix中培養(yǎng)細(xì)胞可附著于材料上,但較難成管化,0.5％的PuraMatrix中培養(yǎng)7天能夠成管化。三種細(xì)胞密度相比,107個/mL的細(xì)胞密度EPCs更容易體外成管化。NSCs在水凝膠中能夠遷移分化,并且0.5％PuraMatrix較20％Matrigel中細(xì)胞向神經(jīng)元

15、樣細(xì)胞分化比例較高。
　　 結(jié)論:Matrigel和PuraMatrix在適當(dāng)?shù)臐舛?20％Matrigel和0.5％PuraMatrix)均能與培養(yǎng)細(xì)胞良好的相容,并且起到支撐作用,模擬正常生理狀態(tài),給細(xì)胞提供一個三維生長環(huán)境,并且能夠促進(jìn)NSCs細(xì)胞分化。由于PuraMatrix為人工合成肽產(chǎn)物,降解產(chǎn)物無毒性,可能是更適合移植的生物材料。
　　 目的:觀察體外擴(kuò)增的干、祖細(xì)胞及生物工程水凝膠材料共同移植對腦損傷后的

16、神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　 方法:健康成年Wistar近交系大鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、生理鹽水移植組、單純水凝膠移植組、EPCs聯(lián)合水凝膠移植組、NSCs聯(lián)合水凝膠移植組、NSCs和EPCs聯(lián)合水凝膠移植組。采用改良自由落體撞擊腦損傷模型,損傷7天時于原損傷區(qū)行移植術(shù),分別于動物造模成功后6天、移植術(shù)后1、2、3、4周進(jìn)行肢體運用不對稱試驗、運動評價,移植術(shù)后30天行水迷宮實驗。移植35天處死實驗動物,完整取腦常規(guī)石蠟固

17、定,包含損傷灶的腦組織行連續(xù)冠狀位切片。HE染色后計算損傷所致空腔體積,分析各組損傷恢復(fù)情況。FITC-dextran灌注觀察損傷局部血管分布情況。免疫組織熒光化學(xué)法染色,分析移植細(xì)胞的存活和遷移情況,以及損傷灶局部組織修復(fù)的病理改變。
　　 結(jié)論:體外擴(kuò)增NSCs、EPCs及生物工程水凝膠材料共移植有促進(jìn)局灶性腦外傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的作用,其中生物工程水凝膠材料能夠為移植細(xì)胞提供物理支持和攀附支架,EPCs能夠參與損傷局部的血