成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的分離與培養(yǎng).pdf

1、糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的代謝性疾病，而傳統(tǒng)的藥物和胰島素治療方法卻不能根治該病。近年來，隨著移植技術(shù)的發(fā)展和免疫抑制劑的改進(jìn)，胰島移植治療糖尿病取得了一定的療效，但是由于供體來源短缺，胰島移植治療糖尿病技術(shù)的應(yīng)用受到了制約。胰腺干細(xì)胞是存在于胰腺組織中的成體干細(xì)胞，能夠自我更新并具有多向分化潛能。出生后，胰腺導(dǎo)管組織仍然存在干細(xì)胞，稱為成體胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞。體外分離增殖胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化形成功能性胰島移植治療糖尿病，是有效解

2、決供體短缺的途徑之一，具有重要的意義。但是，國(guó)內(nèi)至今尚無成年哺乳動(dòng)物胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞建系的研究。本研究以SD成年大鼠為試驗(yàn)材料，建立了1例類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系，并對(duì)其分離培養(yǎng)體系、生長(zhǎng)特性、表達(dá)特性及裸鼠荷瘤等進(jìn)行了探討。成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系的建立和生物學(xué)特性的研究，對(duì)于進(jìn)一步研究成年哺乳動(dòng)物胰腺組織再生和利用細(xì)胞移植治療糖尿病具有重要的學(xué)術(shù)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究的主要內(nèi)容包括：
　　1．成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)

3、胞系的建立
　　以成年大鼠胰腺組織為試驗(yàn)材料，0.1 g/mLⅣ型膠原酶消化胰腺組織獲得單個(gè)胰腺細(xì)胞，Dextron葡聚糖不連續(xù)密度梯度離心分離得到胰腺導(dǎo)管細(xì)胞。RPMI-1640+10％FBS+0.11 g/L丙酮酸鈉+2.383 g/L Hepes基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，原代上皮樣胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞和少量成纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。0.25%胰蛋白酶+0.04 g/L EDTA·2Na消化傳代，逐漸剔除成纖維樣細(xì)胞及其它細(xì)胞，獲得純化的上皮樣胰腺

4、導(dǎo)管干細(xì)胞?？寺…h(huán)挑選單個(gè)細(xì)胞增殖而來的細(xì)胞簇，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10 ng/mL EGF擴(kuò)增培養(yǎng)，傳代，建立1例成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系。該細(xì)胞系已傳至33代。倒置顯微鏡下觀察類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈多角形上皮樣；當(dāng)生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，呈“鋪路石”樣。傳代培養(yǎng)1~2 d，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，3~4 d，細(xì)胞開始倍增。從干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和傳代情況看，該成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞具有無限增殖潛能。
　　以80%RPMI-1640+10%F

5、BS+10%DMSO為細(xì)胞保存液，采用4℃，30 min→－80℃，12 h→－196℃程序性降溫，液氮中已冷凍保存成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞86管，1×109個(gè)細(xì)胞；37℃水浴迅速解凍，成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞解凍成活率≥90.8%。
　　隨機(jī)取傳至31代的成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞擴(kuò)增至單層，加入終濃度為0.1μg/mL的秋水仙素處理細(xì)胞5 h，0.4%氯化鉀低滲30 min，固定，滴片，染色，制備染色體標(biāo)本。結(jié)果顯示成年大鼠類胰

6、腺導(dǎo)管干細(xì)胞染色體是正常的二倍體（2n=42）。
　　2．不同生長(zhǎng)因子對(duì)成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖的影響
　　以RPMI-1640+10%NBS為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別添加濃度為5、10、15 ng/mL的生長(zhǎng)因子EGF、bFGF、IGF-Ⅱ或KGF，擴(kuò)增成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞。采用CCK-8法測(cè)定第1~7 d的細(xì)胞數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加這些生長(zhǎng)因子均能促進(jìn)成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖，其中，添加15

7、 ng/mL EGF或10、15 ng/mL bFGF或10、15 ng/mL KGF，能夠顯著促進(jìn)成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖。
　　3．成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的表達(dá)特征
　　隨機(jī)取傳至22代的成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞，采用免疫熒光化學(xué)反應(yīng)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其蛋白表達(dá)特性。免疫熒光化學(xué)反應(yīng)結(jié)果顯示成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞表達(dá) CK19，不表達(dá)胰島干細(xì)胞標(biāo)記物（Nestin、Ngn3、Ptf1a、NeuroD2、Pdx-1）

8、、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物（Sox-2）、胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物（Ghrelin）及胰腺終末分化細(xì)胞標(biāo)記物（Somatostatin、Secretin、Insulin、Glucagon、AKP）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞表達(dá)Pax4、Pax6、Oct-4、Nanog和PCNA，不表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物CD15/SSEA-1、胰島干細(xì)胞標(biāo)記物MafA和造血干細(xì)胞標(biāo)記物（CD34、CD117/c-kit及CD45）。
　　4．成