小鼠骨髓衍生肝干細胞體外擴增及體內(nèi)分化的實驗研究.pdf

1、目前治療肝功能衰竭最常用的方法是肝移植，但由于供體匱乏、免疫排斥和高額費用等問題，肝移植的運用受到了一定的限制。骨髓細胞可以分化形成肝細胞的特定干細胞群，被稱之為骨髓衍生肝干細胞(bonemarrowderivedliverstemcellsBMDLSC)，為肝臟疾病治療提供了新思路和新手段。雖然BMDLSC的存在已被眾多學者公認，但具體細胞表型還存在爭議。Lagasse[1]在酪氨酸小鼠研究中發(fā)現(xiàn)c-kit+Sea+Lin-細胞向肝細

2、胞分化的能力比較強，而后唐等[2]在放射性小鼠肝損傷修復的研究中更是進一步指出c-kit+Lin-(CD117)是一群富含BMDLSC的骨髓干細胞群。與其它類型的骨髓干細胞類似，c-kit+Lin-細胞的數(shù)量有限，難以滿足未來應用的需要。 本實驗利用免疫活性細胞磁珠分選法(MagneticactivatedcellseparationMACS)對雄性小鼠骨髓c-kit+Lin-細胞進行分選提純[3]。根據(jù)相關(guān)文獻，參照臍血造血干

3、細胞、骨髓造血干細胞的體外擴增培養(yǎng)，我們選用SCF+HGF+FL+LIF+TPO因子組合中添加不同濃度的IL-3，在STEMPRO-34SFM無血清培養(yǎng)基中對其進行體外擴增，流式細胞術(shù)檢測c-kit+Lin-細胞數(shù)及細胞凋亡率，得出IL-3最佳濃度。將剛分選及擴增后c-kit+Lin-細胞移植入酒精性肝纖維化雌性模型小鼠體內(nèi)，檢測移植前后酒精性肝纖維化模型雌性小鼠的肝功能，利用原位雜交的方法檢測雌性小鼠肝臟中存在Y染色體性別決定基因cD

4、NA(SRY)陽性和白蛋白mRNA陽性的細胞數(shù)量，比較兩組小鼠的肝臟形態(tài)、肝功能變化和移植細胞的分布、分化及歸巢情況。為將來臨床上進行骨髓衍生肝干細胞肝內(nèi)移植治療肝疾病的研究奠定基礎(chǔ)。 材料和方法： 1.小鼠骨髓干細胞c-kit+Lin-分離和檢測 1.1免疫活性細胞磁珠分選法(MagneticactivatedcellseparationMACS)分選BMDLSC。 取6～8周SPF級BALB/c雄性小

5、鼠，無菌條件下收集其骨髓細胞，采用MACS方法分離c-kit+Lin-細胞。 1.2流式細胞儀檢測細胞純度。 先用PE標記細胞群，將分離前細胞群和分離后細胞群進行比較，可檢測細胞標記在分選前后的純度情況及一抗和抗體磁珠結(jié)合情況。 2.小鼠骨髓干細胞c-kit+Lin-的體外擴增 2.1細胞因子及實驗 分組在SCF+HGF+FL+LIF+TPO因子組合中(SCF、LIF、FL和TPO終濃度為50ng

6、/ml，HGF終濃度為10ng/ml)添加不同濃度的IL-3分為： A：SCF+HGF+FL+LIF+TPO(0ng/ml)； B：SCF+HGF+FL+LIF+TPO+IL-3(10ng/ml)； C：SCF+HGF+FL+LIF+TPO+IL-3(20ng/ml)； D：SCF+HGF+FL+LIF+TPO+IL-3(40ng/ml). 2.2c-kit+Lin-細胞短期培養(yǎng) 培養(yǎng)體系

7、為STEMPRO-34SFM無血清培養(yǎng)基。c-kit+Lin-細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，復種3孔，在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)7天。培養(yǎng)第3天半量換液，第7天檢測總細胞數(shù)(TotalCells)，c-kit+Lin-細胞數(shù)，根據(jù)公式：擴增倍數(shù)=擴增前細胞總數(shù)/擴增后細胞總數(shù)，換算出擴增倍數(shù)。及檢測細胞凋亡率等指標。 2.3流式細胞術(shù)檢測c-kit+Lin-細胞數(shù)及細胞凋亡率 用PE標記細胞群，流式

8、細胞儀檢測c-kit+Lin-細胞數(shù)目及百分率。細胞凋亡的膜聯(lián)蛋白V(annexin-V)用annexin-V-FITC和2μl碘化丙錠PI(50μg/ml)標記，流式細胞儀檢測標記細胞數(shù)目及百分率。 3.同種同品系肝內(nèi)移植干細胞群 3.1分組 酒精性肝損傷模型雌性小鼠32只，隨機分為4組，分別給予移植擴增后的c-kit+Lin-細胞、新鮮分選的c-kit+Lin-細胞、對照組(僅予以注射Buffer2)及空白對

9、照組(直接取血及肝)；另外正常雌性小鼠8只(直接取血及肝)。 3.2肝內(nèi)移植 移植前，將擴增后的c-kit+Lin-細胞、新鮮分選的c-kit+Lin-細胞進行計數(shù)，離心8℃條件，10min，×1500rmp。棄上清，加入Buffer22.5ml重懸細胞。調(diào)節(jié)細胞濃度1×106個/ml，移植組每只予100μ1細胞懸液尾靜脈注射。對照組僅予以注射Buffer2(PBS，PH7.2+0.5％BSA+2mMEDTA)100μl

10、。 3.3移植后肝功能檢查 分別于移植30天后實驗組和對照組活殺小鼠取血清，測量血清中ALT、AST和ALB等肝功能指標。 3.4肝組織常規(guī)病理檢查 解剖小鼠完整取出肝臟組織，石蠟包埋，按標準操作行HE、VG染色，光鏡下觀察結(jié)果。 3.5原位雜交檢查 切片防脫RNA處理。設(shè)計制備并運用小鼠Y染色體性別決定基因cDNA(SRY)探針以及白蛋白mRNA探針，按原位雜交方法操作，熒光顯微鏡下觀察

11、結(jié)果。 方法同上，在同一切片上先行白蛋白mRNA原位雜交，雜交后滴加Y染色體SRY基因DNA探針。在熒光顯微鏡下激發(fā)各自波長，分別照相，并進行圖象融合，觀察干細胞移植分化情況及功能表達。 3.6移植干細胞肝內(nèi)增殖情況 比較每張切片隨機選取10個視野(油鏡)，每個視野細胞數(shù)約20個，記錄雙陽性細胞率。每組取6張切片計數(shù)，了解移植細胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)化情況。 4.統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)用X±S表示。應用SPSS11

12、.5統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)采用單向量方差(One-wayANOVA)和兩獨立樣本t檢驗(Independend-SamplesTTest)分析。P≤0.05表示差別有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.MACS分離c-Kit+lin-細胞純度均達到84％，回收率達到80％以上。 2.在本實驗條件下，IL-3能促使細胞總數(shù)和c-kit+Lin-細胞增殖，擴增倍數(shù)分別為40.29～245.41倍及7.32～15.80

13、倍，并且在一定范圍內(nèi)的濃度具有劑量依賴性，但是超過一定濃度(20ng/ml)的IL-3，再增加劑量對干細胞作用不明顯。IL-3還能有效抑制細胞調(diào)亡，隨著IL-3濃度的上升，而調(diào)亡減少，無IL-3組調(diào)亡率為18.43％，而40ng/ml組調(diào)亡率僅為4-66％。 3.移植擴增后的c-kit+Lin-細胞組和移植新鮮分選的c-kit+Lin-細胞組，在移植30天后的肝功能均有明顯恢復，指標接近正常，兩組比較沒有顯著差異；對照組無明顯變

14、化。 4.兩移植組在移植30天后，HE及VG染色病理切片發(fā)現(xiàn)移植組肝組織少許肝纖維化，對照組肝臟纖維化較明顯。Y染色體SRY基因DNA探針以及白蛋白mRNA雙重原位雜交結(jié)果表明：兩移植組可見移植細胞在肝內(nèi)定居并轉(zhuǎn)化成有功能的肝細胞。計數(shù)細胞比例，兩組無顯著差異。 結(jié)論： 1.MACS細胞分選系統(tǒng)能有效分選c-kit+Lin-細胞，純度和回收率均較高。 2.在本實驗條件下，IL-3能促使c-kit+Lin-

15、細胞增殖，并且在一定范圍內(nèi)的濃度具有劑量依賴性，最佳濃度為20ng/ml，再增加劑量對干細胞作用不明顯。IL-3還能有效抑制細胞調(diào)亡。 3.移植擴增后的c-kit+Lin-細胞組、移植新鮮分選的c-kit+Lin-細胞組，均能明顯改善肝損傷小鼠的肝功能；在受體小鼠肝臟可檢測到移植細胞在肝內(nèi)定居并轉(zhuǎn)化成有功能新生肝細胞；兩移植組肝功能改善、新生肝細胞數(shù)量沒有顯著差異，說明在本實驗條件下，擴增對c-Kit+lin-細胞的歸巢、在體內(nèi)