高純度輔酶A的制備及釋藥系統(tǒng)研究.pdf

1、高脂血癥是臨床常見的脂類代謝失衡疾病，脂質(zhì)代謝紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化與冠心病最重要的危險(xiǎn)因素，隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的改變，高脂血癥的發(fā)病率連年上升，已高達(dá)10％以上，血脂異常是高血壓、冠心病等疾病的重要誘發(fā)因素之一，防治脂質(zhì)代謝紊亂被看作是防治冠心病的重要措施，能顯著降低冠心病的死亡危險(xiǎn)性。
　　目前市場上的調(diào)血脂藥物主要有他汀類、貝特類、煙酸類、膽固醇吸收抑制劑等。長期使用普遍存在毒副作用大、不良反應(yīng)多等問題，因此研發(fā)新

2、的安全有效的治療高脂血癥的藥物意義重大。
　　輔酶A是人體內(nèi)乙酰化酶的輔酶，直接參與了人體三羧酸循環(huán)，具有降低膽固醇，調(diào)節(jié)血漿脂肪含量，防止膽固醇在血管壁的沉積以及血管動(dòng)脈粥樣硬化的作用，臨床可用于脂類代謝異常引起的疾病及其他疾病的輔助治療。目前臨床使用的輔酶A制劑為凍干注射劑，輔酶A作為人體內(nèi)必需的輔酶，本身沒有毒副作用，但由于現(xiàn)有輔酶A原粉純度低(≤85％)、雜質(zhì)含量高，臨床使用輔酶A制劑常發(fā)生不良反應(yīng)，而通常情況下，藥品純度

3、越高，有關(guān)物質(zhì)越少，產(chǎn)品質(zhì)量越高，臨床使用的安全性越好，為了減少臨床不良反應(yīng)，使輔酶A制劑更加安全有效，提高輔酶A純度具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。此外，現(xiàn)有的輔酶A注射劑在治療代謝失衡類疾病時(shí)，需長期每天注射給藥，給患者帶來了疼痛等不適，順應(yīng)性差。為了減少注射給藥頻次、提高臨床用藥的順應(yīng)性，改進(jìn)給藥方式，引入新型藥物釋放系統(tǒng)，開發(fā)出輔酶A緩控釋長效制劑具有重要意義。
　　圍繞提高輔酶A原粉純度、研發(fā)新型輔酶A藥物釋放系統(tǒng)，本論文主要開

4、展了以下幾個(gè)方面的工作:
　　(1)研究了輔酶A的制備工藝與pH值、純度的關(guān)系，以及其凍干工藝。通過改進(jìn)輔酶A制備工藝，制得高純度輔酶A溶液（純度≥95％）;引入冷凍干燥技術(shù)，研究輔酶A純度、凍干工藝與晶形結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，對凍干所得產(chǎn)品進(jìn)行X-粉末衍射、顯微觀察和加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果表明，優(yōu)化制備得到的輔酶A凍干粉具有良好的微觀結(jié)構(gòu)，克服了以往無定形輔酶A純度低、穩(wěn)定性差的不足，具有結(jié)晶度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。從而能為輔酶A制劑的臨床

5、安全使用提供高品質(zhì)原料藥。
　　(2)研究了以葡聚糖-20(Dex)為原料，分別采用微乳液聚合法、溶液聚合法和冷凍干燥法合成Dex微凝膠的方法。實(shí)驗(yàn)表明，普通干燥法制得Dex微凝膠粒徑分布不均勻，本論文采用溶液聚合法和冷凍干燥法相結(jié)合的方法，在水相體系中制得粒徑分布均勻的Dex微凝膠，在此基礎(chǔ)上，為了將Dex微凝膠的溶脹性能及環(huán)境響應(yīng)性和PVA宏觀凝膠的力學(xué)性能有效結(jié)合起來，采用微波-凍融、真空冷凍干燥等技術(shù)在聚乙烯醇(PVA)宏

6、觀凝膠的網(wǎng)絡(luò)中嵌入30％Dex微凝膠，形成一種新型結(jié)構(gòu)的Dex/PVA復(fù)合凝膠。通過透射電鏡(TEM)、紅外光譜（IR）、掃描電鏡(SEM)、激光粒度分析(DLS)以及X-粉末衍射(XRD)等分析手段對Dex微凝膠、Dex/PVA復(fù)合凝膠進(jìn)行了結(jié)構(gòu)形貌表征。
　　(3)以高純度輔酶A作為模型藥物，含有30％Dex的PVA復(fù)合凝膠為載藥材料，制備裝載有輔酶A的緩控釋復(fù)合凝膠、并進(jìn)一步制成長效緩釋皮下植入劑，首先在模擬人體環(huán)境的磷酸緩

7、沖溶液中進(jìn)行皮下植入劑的體外釋放試驗(yàn)，再以SD雄性大白鼠為實(shí)驗(yàn)對象，考察皮下植入劑體內(nèi)釋放行為。結(jié)果顯示:在0～30d內(nèi)，體外釋藥曲線回歸方程:y=2.1818x+43.636(R=0.7781)，體內(nèi)釋藥曲線回歸方程:y=2.5121x+29.5(R=0.8769);以植入劑在體內(nèi)和體外釋放的數(shù)據(jù)按時(shí)間配對，進(jìn)行線性回歸，則0～30d內(nèi)的回歸方程為:y=0.9478x+12.69(R=0.9683)。
　　(4)以葡聚糖-20(

8、Dex)和聚乳酸(PLA)為原料，引入微波輻照技術(shù)和冷凍干燥技術(shù)，采用一步熔融法合成了接枝率(142％)和轉(zhuǎn)化率(46％)都比較理想的Dex-g-PLA。所得Dex-g-PLA兼具了葡聚糖的親水性和聚乳酸的生物相容性。通過紅外光譜、核磁共振對Dex-g-PLA進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，同時(shí)X-粉末衍射顯示PLA-g-Dex為具有晶形結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。
　　(5)以Dex-g-PLA共聚物為載藥材料，用高純度輔酶A作為模型藥物，采用復(fù)乳法聯(lián)合冷凍干

9、燥技術(shù)制成包封有輔酶A的注射用Dex-g-PLA載藥微球，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，獲得粒徑分布均勻、收率(68.6％)和包封率(86.8％)理想的載藥微球。先在模擬人體環(huán)境的磷酸緩沖溶液中進(jìn)行載藥微球的體外釋放試驗(yàn)，再以SD雄性大白鼠為實(shí)驗(yàn)對象，考察載藥微球在大白鼠體內(nèi)的釋藥行為。結(jié)果表明，在0～30d內(nèi)，體外釋藥曲線回歸方程:y=2.8424t+22.727(R=0.9163)，體內(nèi)釋藥曲線回歸方程:y=2.6182t+18.455(R=0

10、.9342);以載藥微球在體內(nèi)釋放和體外釋放的數(shù)據(jù)按時(shí)間配對，進(jìn)行線性回歸，則0～30d內(nèi)的回歸方程為:y=l.0842x+2.3473(R=0.9967)。微球的體外累積釋放與體內(nèi)吸收分?jǐn)?shù)呈明顯的正相關(guān)，相關(guān)性良好。
　　(6)分析評估皮下植入劑和載藥微球的體內(nèi)體外釋放試驗(yàn)，在0～30d內(nèi)，輔酶A釋藥系統(tǒng)體外釋藥相關(guān)系數(shù)R植入劑=0.7781＜R微球=0.9162，體內(nèi)釋藥相關(guān)系數(shù)R植入劑=0.8769＜R微球=0.9342;在

11、0～30d內(nèi)，將輔酶A釋藥系統(tǒng)在體內(nèi)、體外釋放的數(shù)據(jù)按時(shí)間配對，進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)R植入劑=0.9683＜R微球=0.9967。結(jié)果說明輔酶A載藥微球體內(nèi)體外釋放的線性和相關(guān)性皆優(yōu)于輔酶A植入劑，可以作為優(yōu)選的輔酶A釋藥系統(tǒng)。
　　(7)選擇清潔級SD雄性大白鼠建立高脂血癥動(dòng)物模型，以辛伐他汀作為陽性對照藥，用包封有輔酶A的載藥微球注射給藥，對高脂血癥大白鼠降血脂的藥效學(xué)進(jìn)行初步研究，載藥微球一次肌注給藥后觀察4周，結(jié)果顯示:

12、隨著使用劑量的增加，對大白鼠高脂血癥的作用更加明顯，中劑量和高劑量載藥微球能持續(xù)顯著降低高脂血癥大白鼠血清的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，低劑量組能持續(xù)降低高脂血癥大白鼠血清的TG，對血清的TC、LDL-C雖有降低作用但無顯著性;小劑量、中劑量和大劑量載藥微球?qū)Ω咧Y大白鼠血清的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)都有所升高，但升高無顯著性;辛伐他汀陽性組對高血脂癥大白鼠血清的TG作用與中劑量載藥微

13、球的作用類似，但明顯弱于高劑量組;陽性組對高血脂癥大白鼠血清的TC、LDL-C降低作用較中劑量載藥微球作用明顯，而較高劑量載藥微球的作用稍弱，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)辛伐他汀陽性組對高血脂癥大白鼠血清的HDL-C升高作用較低劑量和中劑量載藥微球稍強(qiáng)，而較高劑量載藥微球的升高作用稍弱，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　綜上所述，本課題采用回溫冷凍干燥技術(shù)制備高純度輔酶A的方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。以Dex為原料，首次引入冷凍干燥技術(shù)在水相體系中制得粒徑分布

14、均勻的Dex微凝膠，在此基礎(chǔ)上采用微波-凍融和真空冷凍干燥相結(jié)合形成新型結(jié)構(gòu)的Dex/PVA復(fù)合凝膠，并進(jìn)一步制得載有高純度輔酶A的皮下植入劑。以Dex和PLA為原料，首次引入微波技術(shù)和冷凍干燥技術(shù)，采用一步熔融法合成了Dex-g-PLA。結(jié)合復(fù)乳法和冷凍干燥技術(shù)，制成包封率和收率較為理想的包封有輔酶A的注射用載藥微球。分別以模擬人體環(huán)境的磷酸緩沖溶液和SD雄性大白鼠為實(shí)驗(yàn)條件，通過分析評估植入劑和載藥微球在體內(nèi)體外的釋放效果，優(yōu)選出輔