小膠質(zhì)細(xì)胞Hv1促進(jìn)慢性低灌注白質(zhì)損傷及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：電壓-門控質(zhì)子通道，即 Hv1，對(duì)質(zhì)子具有高度選擇性，對(duì) NADPH氧化酶依賴的活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生是非常必要的，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性和功能性表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞。而小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，其M1, M2分型對(duì)白質(zhì)的損傷，再生，修復(fù)具有非常重要的作用。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞大量產(chǎn)生ROS,而Hv1-/-小膠質(zhì)細(xì)胞ROS大量減少，那么Hv1-/-對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的分型是否有影響，是否

2、能夠?qū)Π踪|(zhì)損傷有保護(hù)性作用呢？
　　方法：用雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄（bilateral common carotid artery stenosis, BCAS）建立慢性低灌注腦白質(zhì)損傷所致血管性認(rèn)知功能障礙小鼠模型。免疫熒光檢測(cè)髓鞘堿性蛋白MBP,髓鞘糖蛋白 MAG,去磷酸化神經(jīng)絲 Smi32，神經(jīng)絲重鏈蛋白 NF200,在小鼠BCAS模型后表達(dá)量的改變。免疫熒光雙標(biāo)少突膠質(zhì)細(xì)胞上的Nfasc155和軸突上的caspr蛋白觀察朗飛節(jié)側(cè)

3、區(qū)隔板樣結(jié)構(gòu)；熒光雙標(biāo)Nav1.6和caspr觀察朗飛節(jié)區(qū)Nav1.6通道長(zhǎng)度的改變。免疫熒光雙標(biāo)CD16/32和Iba1計(jì)數(shù)野生型（wild type,WT）和Hv1-/-型小鼠Sham組及BCAS組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目；免疫熒光雙標(biāo)CD206和Iba1計(jì)數(shù)上述分組 M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目。體外培養(yǎng) WT和 Hv1-/-小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞，用LPS+IFNγ或者IL-4誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M1型或者M(jìn)2型，qPCR檢測(cè)CD16/32, iNOS

4、, TNFα; CD206, Arg1，CCL22等指標(biāo)mRNA表達(dá)變化，Western Blot技術(shù)檢測(cè)iNOS, CD16/32, CD206, Arg1蛋白表達(dá)變化。八臂迷宮檢測(cè)小鼠行為學(xué)的改變。
　　結(jié)果：在模型組Nfasc155和caspr共定位系數(shù)降低，MAG表達(dá)明顯減少，說(shuō)明BCAS術(shù)后出現(xiàn)軸突膠質(zhì)微結(jié)構(gòu)的破壞；Smi32表達(dá)升高，而NF表達(dá)無(wú)明顯變化，說(shuō)明胼胝體中軸突纖維出現(xiàn)去磷酸化，輕微受損；BCAS模型后，與

5、Sham組相比，Hv1-/-組共定位系數(shù)較高，MAG蛋白表達(dá)也多，Smi32表達(dá)減少，說(shuō)明Hv1敲除對(duì)慢性低灌注導(dǎo)致的損傷有保護(hù)性作用；八臂迷宮行為學(xué)顯示H v1-/-模型組小鼠認(rèn)知能力明顯好于WT模型組；BCAS模型后，通過(guò)胼胝體的CD16/32與Iba1雙標(biāo)顯示Hv1-/-組的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯少于WT組，而CD206與Iba1雙標(biāo)顯示Hv1-/-組的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯多于 WT組；體外小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)成 M1, M2

6、型，檢測(cè)mRNA表達(dá)水平及WB檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示相對(duì)WT組，Hv1-/-小膠質(zhì)細(xì)胞CD16/32,iNOS等M1標(biāo)志物表達(dá)水平下降，CD206, Arg1等M2標(biāo)志物表達(dá)水平升高；體內(nèi)外的結(jié)果顯示Hv1基因敲除有助于小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)BCAS模型中脫髓鞘病理改變的保護(hù)作用。
　　結(jié)論：相較于野生型C57模型組小鼠，Hv1-/-模型組小鼠在分子細(xì)胞水平和行為學(xué)水平均顯示出對(duì)白質(zhì)損傷的保護(hù)作用。一系列體內(nèi)外實(shí)