人源電壓門控質(zhì)子通道Hv1結(jié)構(gòu)功能的研究.pdf

1、電壓門控鉀離子通道為同源四聚體蛋白,每個亞基由一個電壓感受結(jié)構(gòu)域(S1-S4)和一個孔結(jié)構(gòu)域(S5-S6)構(gòu)成,其中電壓感受結(jié)構(gòu)域(VSD)起著感受膜電位并控制通道開關(guān)的作用。新近發(fā)現(xiàn)的人源電壓門控質(zhì)子通道(Hv1)的編碼基因與電壓門控鉀離子通道電壓感受結(jié)構(gòu)域(VSD)同源類似,但不含有鉀離子通道的孔結(jié)構(gòu)域。電壓門控質(zhì)子通道Hv1對質(zhì)子具有特異高選擇性,能夠高效地跨膜轉(zhuǎn)運質(zhì)子。依據(jù)該通道各氨基酸殘基的疏水特性,可將Hv1蛋白全長劃分為3

2、個結(jié)構(gòu)域:N-端胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C-端胞外結(jié)構(gòu)域。
　　 本論文中,以Hela細胞作為工具細胞,表達全長Hv1及其變異體蛋白,并利用Tim23多克隆抗體作為探針標記細胞線粒體。研究發(fā)現(xiàn)Hv1表達在Hela細胞的線粒體上,并且其C-端胞外結(jié)構(gòu)域?qū)v1的亞細胞定位具有重要的作用。
　　 為進一步研究Hv1的C-端胞外結(jié)構(gòu)域(C—Hv1)對該通道的影響,以大腸桿菌BL21(DE3)作為重組蛋白表達用的受體菌,獲得了大

3、量可溶性目的蛋白。通過親和層析、陽離子交換層析和分子篩層析技術(shù)對目的蛋白進行純化,得到了高純度的C-Hv1。利用圓二色光譜、尺寸排阻色譜和超離心沉降平衡分析等技術(shù)研究了C-Hv1在不同pH值條件下的結(jié)構(gòu)特性。實驗結(jié)果表明該蛋白在不同pH值條件下均含有α螺旋二級結(jié)構(gòu),并形成二聚體。
　　 運用氣相擴散懸滴法結(jié)晶出了C-Hv1高分辨率晶體,收集了2.0(A)分辨率的衍射數(shù)據(jù),解析出了該蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)。解析結(jié)果表明該蛋白為平行的α