電壓門控鈉離子通道及錨蛋白在顳葉內(nèi)側(cè)癲癇中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 癲癇是腦部神經(jīng)元高度同步化異常放電所致，以發(fā)作性、短暫性、重復(fù)性及刻板性為特征的的一組中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常綜合征。神經(jīng)元胞膜興奮性增高，易于形成癇性放電，是癲癇發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。電壓門控鈉離子通道的結(jié)構(gòu)和功能異?？梢鹕窠?jīng)元的膜興奮性改變，在癲癇的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。目前初步推測電壓門控鈉離子通道的改變以及其調(diào)控蛋白的變化，均可能參與這一機(jī)制。 哺乳動物電壓門控鈉離子通道組成孔區(qū)的α亞單位可由同一家族的

2、9個基因編碼，其中Nav1.1和Nav1.6在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)。對特發(fā)性全面性癲癇，如全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥，嬰兒重癥肌陣攣癲癇的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)：α亞單位Nav1.1編碼基因SCNIA的突變，導(dǎo)致持續(xù)鈉電流增加，提高神經(jīng)元興奮性參與癲癇的發(fā)生機(jī)制。而且，VGSC是多種常見抗癲癇藥物的作用靶點(diǎn)。因此VGSC的改變導(dǎo)致神經(jīng)元放電模式變化可能參與癲癇的發(fā)病機(jī)制。 最近對于實驗動物和人類的獲得性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇的研究提示獲得性癲癇也可能因

3、為鈉通道的表達(dá)改變，導(dǎo)致功能的變化，出現(xiàn)鈉電流的異常。海馬NaV1.1的mRNA的水平在匹羅卡品和紅藻氨酸模型大鼠未見明顯改變，但是人類顳葉內(nèi)側(cè)癲癇手術(shù)標(biāo)本的原位雜交提示NaV1.1的mRNA水平升高。匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞NaV1.6的mRNA水平在急性期和慢性自發(fā)癲癇形成期均見明顯降低，而點(diǎn)燃模型的研究發(fā)現(xiàn)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的NaV1.6的mRNA和蛋白水平均持續(xù)升高。因此有必要對獲得性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇模型海馬C

4、A1區(qū)進(jìn)行mRNA和蛋白水平的觀察進(jìn)一步了解該蛋白表達(dá)的變化。 錨蛋白重復(fù)序列家族是一個結(jié)合體蛋白的家族，含有數(shù)量不等的ankyrin重復(fù)膜體(，把各種膜相關(guān)蛋白和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白定位在細(xì)胞膜的特異性區(qū)域上，因結(jié)合的胞漿蛋白不同產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞膜錨蛋白基因ANK2突變導(dǎo)致一組遺傳性心律失常綜合征，提示離子通道病變以外的原發(fā)性心律失常的發(fā)病機(jī)制。對于同樣是可興奮性細(xì)胞的神經(jīng)元相關(guān)的興奮性改變，也可能與這一和離子通道相關(guān)聯(lián)的

5、蛋白的改變有關(guān)。Nav1.6的膜內(nèi)結(jié)合蛋白錨蛋白—G的膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域可調(diào)節(jié)Nav1.6的持續(xù)鈉電流。但是在獲得性癲癇動物模型中尚未見其表達(dá)及功能的改變的報道。 綜上所述，電壓門控鈉離子通道α亞單位NaV1.1和NaV1.6以及其調(diào)節(jié)蛋白ankyrin—G在獲得性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇形成機(jī)制中的作用和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 研究目的： 通過檢測NaV1.1和NaV1.6的表達(dá)隨著顳葉內(nèi)側(cè)癲癇形成的時程和空間分布改變，了解顳葉內(nèi)

6、側(cè)癲癇形成是否與NaV1.1和NaV1.6的表達(dá)改變相關(guān)；通過同步檢測Ankyrin—G表達(dá)的改變，了解在顳葉內(nèi)側(cè)癲癇形成中Ankyrin—G是否影響NaV1.1和NaV1.6的表達(dá)；通過檢測顳葉內(nèi)側(cè)癲癇模型海馬神經(jīng)元鈉電流的電生理學(xué)變化，從功能上求證鈉電流改變在顳葉內(nèi)側(cè)癲癇形成中的作用。 研究方法： 1.匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型的建立和鑒定 SD大鼠(6-8周，雌性)隨機(jī)分成匹羅卡品組、假處理組和空白

7、對照組。匹羅卡品組依次注射氯化鋰、丁溴東莨菪堿、匹羅卡品誘發(fā)癩癇持續(xù)狀態(tài)，60min后注射地西泮終止發(fā)作。假處理組大鼠在相應(yīng)時間點(diǎn)注射同等體積生理鹽水替代匹羅卡品，其余操作與處理組相同。同齡空白對照組不給予上述藥物。處理組大鼠被誘發(fā)急性發(fā)作后接受行為學(xué)觀察和腦電監(jiān)測。各組在處理后1天和60天各選取5只SD大鼠進(jìn)行病理學(xué)檢查，經(jīng)多聚甲醛固定后取海馬行冰凍切片，進(jìn)行尼氏染色。 2.熒光實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測目標(biāo)基因表達(dá)量

8、根據(jù)大鼠大腦體視學(xué)圖譜(Paxinos and Watson，1986)，使用12號針頭連接針管在解剖顯微鏡下抽取海馬CA1區(qū)組織。在玻璃勻漿器中加入海馬CA1區(qū)腦組織和RNAiso Reagent Trizol研磨，提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄cDNA后進(jìn)行熒光實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測SCNIA，SCN8A和ANK—3。內(nèi)參為β—actin，選擇Pfaffl法進(jìn)行定量分析。 3.Western blotting檢測目標(biāo)蛋白表達(dá)水平

9、 同上方法抽取海馬CA1區(qū)組織，提取蛋白后檢測蛋白濃度，進(jìn)行Western blotting實驗。電泳轉(zhuǎn)膜后分別使用NaV1.1、NaV1.6、ankyrin—G和內(nèi)參β—actin的抗體孵育，然后孵育相應(yīng)二抗，曝光顯影后對條帶進(jìn)行定量分析。 4.免疫熒光雙標(biāo)檢測目標(biāo)蛋白共表達(dá)水平 前述冰凍切片同時孵育NaV1.6和ankyrin—G的抗體以及相應(yīng)二抗，在熒光顯微鏡下觀察，并對陽性神經(jīng)元進(jìn)行計數(shù)。 5.膜片鉗

10、檢測鈉電流特征 急性分離海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，在全細(xì)胞電壓鉗模式下給予標(biāo)準(zhǔn)刺激方案，根據(jù)所得電流數(shù)據(jù)建立快速鈉電流的激活曲線、失活曲線和失活后復(fù)活曲線，計算持續(xù)鈉電流的最大波幅和激活電壓，進(jìn)行比較。 6.統(tǒng)計學(xué)分析 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，統(tǒng)計方法用SPSS13.0 for Windows軟件包(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用t檢驗、two way ANOVA和o

11、ne—way ANOVA。P<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型的建立和鑒定 急性期匹羅卡品組大鼠出現(xiàn)Racine分級的Ⅳ級或以上發(fā)作。慢性自發(fā)癲癇形成期可見每周2～6次的自發(fā)癲癇發(fā)作。腦電圖檢測：PISE組大鼠給藥前基線腦電背景波幅在30-60μV之間，頻率在6-18Hz之間；急性期可見低于6Hz的慢活動逐漸增多，可見爆發(fā)長程出現(xiàn)的尖活動、棘活動和不規(guī)則的尖慢復(fù)合活動；

12、慢性自發(fā)癲癇形成期，可見背景活動中出現(xiàn)較多散在的頻率低于6Hz的慢活動和散在出現(xiàn)的棘波、多棘波和棘慢復(fù)合波。假處理組和空白對照組大鼠在兩個相應(yīng)時間點(diǎn)腦電監(jiān)測與PISE組大鼠給藥前基線腦電監(jiān)測所見相似。尼氏染色見PISE組匹急性期CA1區(qū)大量錐體細(xì)胞緊密排列，排列整齊，形態(tài)完整，胞漿內(nèi)存在豐富的尼氏小體，僅見少量壞死神經(jīng)元；慢性自發(fā)癲癇形成期見錐體細(xì)胞排列紊亂，投射纖維方向不一，胞漿內(nèi)尼氏小體減少，部分細(xì)胞形態(tài)不完整，細(xì)胞腫脹或者皺縮，輪

13、廓模糊、界限不清，部分神經(jīng)元缺失導(dǎo)致錐體細(xì)胞層中斷。 2.海馬CA1區(qū)NaV1.1和NaV1.6表達(dá)的變化 分期和分組對于SCN1A的的mRNA水平未見顯著性影響。急性期PISE組SCN8A的mRNA低于假處理組和同齡空白對照組，但差別無顯著性意義(P>0.05)；慢性自發(fā)癲癇形成期PISE組SCN8A的mRNA水平比假處理組升高41.08％(P<0.001)，與同齡空白對照組相比升高30.88％(P=0.011)。慢性

14、自發(fā)癲癇形成期PISE組NaV1.6的蛋白水平比假處理組升高66.63％(P<0.001)，與同齡空白對照組相比升高73.88％(P=0.011)。PISE組慢性自發(fā)癲癇形成期NaV1.6蛋白的平均水平比急性期增高12.08％(P=0.022)。 3.海馬CA1區(qū)ankyrin—G表達(dá)的變化 慢性自發(fā)癲癇形成期PISE組ANK—3的mRNA水平比假處理組升高19.76％(P<0.001)，與同齡空白對照組相比升高35.0

15、5％(P<0.001)。PISE組ankyrin—G的蛋白水平比假處理組升高70.21％(P<0.001)，與同齡空白對照組相比升高63.83％(P<0.001)。 4.海馬CA1區(qū)NaV1.6和ankyrin—G共表達(dá)的變化 慢性自發(fā)癲癇形成期，PISE組雙染陽性神經(jīng)元的平均水平較假處理組升高60.80％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，與同齡空白對照組相比升高66.15％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。而且

16、，PISE組大鼠慢性自發(fā)癲癇形成期海馬CA1區(qū)雙染陽性神經(jīng)元較急性期增高62.90％，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。 5.海馬CA1區(qū)神經(jīng)元鈉電流的變化 持續(xù)狀態(tài)后急性期和慢性自發(fā)癲癇形成期PISE組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元短暫鈉電流的激活曲線較假處理組及空白對照組左移，失活曲線右移，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。慢性自發(fā)癲癇形成期PISE組持續(xù)鈉電流的電流幅度較同齡對照組明顯增高(P<0.05)。 結(jié)論： 1

17、.本研究首次在匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)的SD大鼠海馬CA1區(qū)發(fā)現(xiàn)電壓門控鈉離子通道α亞單位NaV1.6表達(dá)水平在慢性自發(fā)癲癇形成期增高，進(jìn)一步的電生理研究提示與該蛋白相關(guān)的持續(xù)鈉電流在模型慢性自發(fā)癲癇形成期增強(qiáng)，提示其參與動物模型獲得性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇的形成機(jī)制。 2.本研究首次在匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)的SD大鼠模型上進(jìn)行海馬CA1區(qū)錨蛋白ankyrin—G表達(dá)水平的研究，發(fā)現(xiàn)在慢性自發(fā)癲癇形成期該蛋白表達(dá)較急性期以及同齡對照組增