幼鼠內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)病機制及丙戊酸早期干預的療效和機理研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 癲癇(epilepsy)是小兒神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，發(fā)病率為3.5‰～6.6‰。內(nèi)側(cè)顳葉癲癇(mesial temporal lobe epilepsy，MTLE)是最常見的難治性癲癇之一，以海馬硬化為其突出的臨床病理特征。迄今為止，MTLE的治療一直是癲癇治療的難點，藥物治療及手術治療都未能取得令人滿意的療效。因此，有關海馬硬化的MTLE綜合征的發(fā)病機制、對抗癲癇藥物治療的反應以及耐藥機制等仍是近幾十年

2、來癲癇研究的熱點與難點。
　　 兒童時期的癲癇以及癲癇綜合征與成年期有很大不同。發(fā)育期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)由于其結(jié)構(gòu)與功能以及與癲癇有關的神經(jīng)遞質(zhì)、受體尚未完全成熟，癇性發(fā)作對未成熟大腦發(fā)生發(fā)展的影響以及未成熟大腦對抗癲癇藥物治療反應都隨著大腦發(fā)育各階段的不同而有很大的差異。大量研究表明，在伴有海馬硬化性顳葉癲癇的成人患者中有相當高比例可追問到兒童早期有長時間癇性發(fā)作史，尤其是熱性驚厥史。幼年早期長時間癇性發(fā)作后大腦可塑性發(fā)生的改變對

3、個體能產(chǎn)生長遠的影響，與MTLE的形成密切相關。因此，研究發(fā)育階段幼鼠癇性發(fā)作后大腦各階段的結(jié)構(gòu)和功能與癲癇發(fā)生發(fā)展的關系以及對抗癲癇藥物治療的反應對于MTLE病理生理研究有著重要的意義。
　　 近年來有關MTLE的研究多集中在神經(jīng)再生和突觸可塑性、神經(jīng)細胞損傷、細胞代謝和蛋白合成、神經(jīng)傳遞和信號傳導、細胞骨架的改變、離子通道等各個方面，但絕大多數(shù)研究均局限于某一個時間點的某一個方面，缺乏系統(tǒng)、連續(xù)的觀察。而癲癇的發(fā)生是不斷發(fā)展

4、和變化的，因此，本研究運用蛋白質(zhì)組學方法，分離鑒定幼鼠MTLE模型發(fā)生發(fā)展的各個時間段差異表達的蛋白質(zhì)，并運用生物信息學技術，將各個階段的差異表達蛋白質(zhì)進行全景式比較分析，功能歸類，從一個整體、連續(xù)發(fā)展的角度探討MTLE發(fā)病機制。在此基礎上，運用廣譜抗癲癇藥物丙戊酸(valproate，VPA)在早期對幼鼠模型進行干預，探討VPA早期干預對幼鼠MTLE模型的療效以及相關治療機制，并收集人難治性MTLE術后海馬標本進行臨床驗證，從多個角度

5、探討難治性MTLE的發(fā)病機制以及VPA早期干預的治療機制，為今后通過藥物治療難治性MTLE提供一個新的視角。
　　 研究方法：
　　 本研究分為三部分：
　　 1.分別用10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、100mg/kg四種劑量的匹羅卡品對3周齡Sprague-Dawley大鼠進行誘導出癲癇發(fā)作，尋求匹羅卡品的最佳致癇劑量；致癇后連續(xù)觀察8周，比較MTLE模型鼠的行為學、腦電圖的改變，尼氏染色

6、以及Timm染色觀察海馬的形態(tài)學改變，對慢性MTLE模型進行鑒定。
　　 2.根據(jù)MTLE發(fā)生發(fā)展過程取三個時間點(急性期、潛伏期、慢性期)一共分為6個組：急性對照組、急性模型組、潛伏對照組、潛伏模型組、慢性自發(fā)發(fā)作組、慢性無發(fā)作組。采用二維凝膠電泳技術分離各組大鼠海馬總蛋白，PDQuest軟件識別各組間差異表達蛋白質(zhì)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進行鑒定，生物信息學軟件對差異表達蛋白質(zhì)進行比較分析、功能歸類，構(gòu)建與幼鼠MT

7、LE發(fā)生發(fā)展相關的差異蛋白相互作用網(wǎng)絡。Western blot技術對部分差異蛋白的表達進行印證。
　　 3.在自發(fā)發(fā)作開始出現(xiàn)的潛伏期末用VPA對MTLE模型持續(xù)干預2周，觀察其對治療的反應，尼氏染色和Timm染色觀察治療后的海馬形態(tài)學改變并進行療效評估；同時，對治療與未治療兩組的大鼠海馬蛋白表達譜進行分析比較，結(jié)合MTLE模型各階段之間的差異表達蛋白譜，尋找與VPA早期干預密切相關的蛋白質(zhì)并運用westernblot技術印證

8、其表達情況。進一步地，收集人難治性MTLE術后海馬標本，western blot檢測其表達情況進行臨床驗證。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.匹羅卡品10 mg/kg組的誘導成功率為0％，30mg組誘導成功率為30％，50 mg/kg組的誘導成功率為60％，100 mg/kg組的誘導成功率為10％，其最佳致癇劑量為50 mg/kg；慢性MTLE模型成功率為63.3％。慢性MTLE模型鼠出現(xiàn)自發(fā)部分運動性發(fā)作，腦電圖呈現(xiàn)典型癲

9、癇樣放電，尼氏染色顯示有神經(jīng)元脫失以及變性、膠質(zhì)細胞增生；Timm染色可見到異常苔蘚纖維出芽，異常興奮環(huán)路形成。
　　 2.建立了幼鼠慢性MTLE模型發(fā)生發(fā)展各個階段的海馬二維凝膠電泳圖譜。共鑒定了各個階段差異表達的蛋白質(zhì)共110個，這些蛋白主要參與的功能有：細胞骨架調(diào)節(jié)、細胞連接、能量代謝、突觸形成和神經(jīng)遞質(zhì)釋放、熱休克蛋白、信號通路調(diào)節(jié)分子等；通過比較分析發(fā)現(xiàn)部分蛋白在癲癇發(fā)生發(fā)展的各個階段有不同表達。并用Western b

10、lot技術對部分差異表達蛋白進行了驗證，其結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組學研究的結(jié)果基本一致。
　　 3.發(fā)現(xiàn)VPA早期干預可完全控制幼鼠MTLE模型的癲癇發(fā)作。尼氏染色和Timm染色的結(jié)果表明VPA具有神經(jīng)保護作用，能阻止神經(jīng)元脫失和異常苔蘚纖維出芽，并發(fā)現(xiàn)突觸相關蛋白synapsin-1、dynamin-1和neurogranin在VPA治療組與未治療組中有差異表達。Western blot技術檢測synapsin-1、dynamin-

11、1和neurogranin在大鼠模型和臨床樣本中的表達水平與比較蛋白質(zhì)組學研究的結(jié)果一致。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.本研究成功誘導出具有自發(fā)發(fā)作的幼鼠慢性MTLE模型，在發(fā)作形式、腦電圖以及海馬形態(tài)學改變等均符合人類MTLE的特征。為今后研究幼年期癇性發(fā)作對成年慢性MTLE的影響以及藥物干預等提供了一個比較理想的實驗性動物模型。
　　 2.首次建立了幼鼠慢性MTLE模型海馬的連續(xù)、動態(tài)的凝膠電泳圖譜；共鑒定了

12、各階段差異表達的蛋白質(zhì)110個，這些蛋白可能與MTLE發(fā)病機制密切相關，為全面探討慢性顳葉癲癇的病理生理機制及尋求最佳的藥物作用靶點提供新的思路。
　　 3.丙戊酸早期干預幼鼠MTLE模型可完全控制癲癇發(fā)作，為今后臨床上藥物控制難治性MTLE提供了可能的最佳干預時間點；突觸相關蛋白synapsin-1、dynamin-1、neurogranin與慢性MTLE模型發(fā)病機制、丙戊酸早期干預的治療機理相關，可能是今后關于難治性MTLE