骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體調(diào)控的炎性效應(yīng)對(duì)慢性低灌注白質(zhì)損傷的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、背景:
　　缺血性白質(zhì)腦病(whitematterlesion)是由大腦半球深穿支小動(dòng)脈(Deepperforatorssmallartery)的廣泛病變,或頸部大動(dòng)脈及其顱內(nèi)分支狹窄,導(dǎo)致持續(xù)腦血流低灌注,從而造成以半卵圓區(qū)及側(cè)腦室旁白質(zhì)疏松為其病理特點(diǎn),臨床以認(rèn)知損害為突出表現(xiàn)的疾病狀態(tài),是中老年血管性認(rèn)知損害的主要類型之一。目前對(duì)于缺血性白質(zhì)腦病的分子病理機(jī)制認(rèn)識(shí)尚不足,因而制約了治療藥物的研發(fā),臨床缺少有效藥物治療手段。因

2、此,迫切需要更深入地探討缺血性白質(zhì)腦病的分子病理機(jī)制,以期進(jìn)而提出有效的治療策略和方法。
　　腺苷是能量代謝的中間產(chǎn)物,也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)。腺苷A2A受體參與機(jī)體多種生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)和某些疾病的病理過程,在某些疾病的臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),腺苷A2A受體及其介導(dǎo)的信號(hào)通路可能成為治療的靶點(diǎn),因此愈來愈受到基礎(chǔ)和臨床研究者的重視。目前,以腺苷A2A受體作為治療靶點(diǎn)的多種藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn),包括帕金森病、Huntingt

3、on病、全身炎性反應(yīng)綜合征和艾滋病等的藥物臨床試驗(yàn)。
　　本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)慢性低灌注白質(zhì)損傷病理機(jī)制不同于急性缺血性腦損傷,腺苷A2A受體介導(dǎo)的炎性效應(yīng)是影響慢性低灌注白質(zhì)損傷結(jié)局的重要因素。腺苷A2A受體也存在于外周血液中骨髓來源細(xì)胞,Yu等在急性腦缺血的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體的選擇性缺失影響腦組織內(nèi)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,提示骨髓來源細(xì)胞A2A受體可能對(duì)缺血誘導(dǎo)的腦內(nèi)炎性反應(yīng)產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用。
　　為

4、了進(jìn)一步探討腺苷A2A受體介導(dǎo)的效應(yīng)對(duì)慢性低灌注白質(zhì)損傷炎性病理過程產(chǎn)生影響的可能機(jī)制,我們進(jìn)行了以下研究:①利用腺苷A2A受體基因敲除動(dòng)物,采用骨髓移植細(xì)胞嵌合的方法建立骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體選擇性缺失和選擇性重建的動(dòng)物模型,觀察對(duì)慢性低灌注白質(zhì)損傷的影響,以明確腺苷作用于A2A受體并對(duì)慢性低灌注白質(zhì)損傷產(chǎn)生影響的具體效應(yīng)細(xì)胞;②檢測(cè)慢性腦血流低灌注誘導(dǎo)的局限表達(dá)于免疫細(xì)胞和炎細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子CystatinF表達(dá)的改變,并觀察

5、干預(yù)腺苷A2A受體活性對(duì)其表達(dá)及慢性低灌注白質(zhì)損傷結(jié)局的影響,探討腺苷A2A受體對(duì)慢性低灌注白質(zhì)損傷產(chǎn)生影響的下游分子病理途徑;⑧檢測(cè)慢性腦血流低灌注誘導(dǎo)的白質(zhì)損傷區(qū)域前炎性細(xì)胞因子表達(dá)的變化,以及干預(yù)腺苷A2A受體活性對(duì)其表達(dá)的影響,探討與慢性低灌注白質(zhì)炎性病理?yè)p傷有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　引進(jìn)腺苷A2A受體基因敲除(A2Areceptorgeneknock-out,A2AR/KO)雜合

6、子小鼠交配繁殖,聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)方法鑒定A2AR/KO小鼠和野生型(wild-typelittermates,A2AR/WT)小鼠。
　　2.骨髓移植細(xì)胞嵌合模型的建立
　　采用骨髓移植細(xì)胞嵌合的方法建立骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體選擇性缺失及選擇性重建模型。即放射線破壞雄性野生型或A2AR/KO小鼠骨髓后,移植雌性A2AR/KO小鼠骨髓細(xì)胞至野生型小鼠構(gòu)建骨髓來源細(xì)胞腺苷

7、A2A受體選擇性缺失模型(KO—WT),骨髓細(xì)胞移植WT—WT組作為其對(duì)照;移植雌性野生型小鼠骨髓細(xì)胞至A2AR/KO個(gè)鼠構(gòu)建骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體選擇性重建模型(WT—KO),骨髓細(xì)胞移植KO—KO組作為其對(duì)照;PCR法檢測(cè)雄性受體外周血性染色體及免疫熒光法檢測(cè)外周血白細(xì)胞A2A受體表達(dá),鑒定骨髓移植細(xì)胞嵌合模型是否成功建立。
　　3.慢性腦血流低灌注模型的建立
　　參照Shibata等方法,用內(nèi)徑為0.18mm的微型

8、彈簧圈套雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立小鼠慢性腦血流低灌注模型,建模前及建模后2h監(jiān)測(cè)腦血流以判斷模型是否成功;建模前及建模后4w,對(duì)部分動(dòng)物行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),記錄每只動(dòng)物發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的平均潛伏期和穿越平臺(tái)的次數(shù),以此為指標(biāo)評(píng)價(jià)空間學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　4.腺苷A2A受體激動(dòng)劑干預(yù)
　　給予慢性腦血流低灌注野生型小鼠和骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體選擇性重建小鼠腺苷A2A受體激動(dòng)劑CGS21680(0.25mg/kg,腹膜腔注射,1次/d

9、,直至各組動(dòng)物觀察終點(diǎn),即腦缺血后第2w、4w和6w,比較非選擇性激活與選擇性激活骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體對(duì)于慢性腦血流低灌注白質(zhì)損傷及炎性病理反應(yīng)的影響。
　　5.白質(zhì)損傷、小膠質(zhì)細(xì)胞增生、炎性因子和CystatinF表達(dá)的檢測(cè)
　　分別于腦缺血后2w、4w和6w取腦標(biāo)本,ZO-1免疫組化染色法觀察血腦屏障開放程度,Kluver-Barrera及Bielschowsky染色法評(píng)價(jià)白質(zhì)損傷,髓鞘堿性蛋白(myelinbas

10、icprotein,MBP)免疫組化染色法觀察髓鞘脫失,比較各組動(dòng)物血腦屏障和白質(zhì)損傷程度。CDllb免疫組織化學(xué)染色方法觀察并計(jì)數(shù)白質(zhì)區(qū)域單位面積(0.25ffiff12)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及增生情況,抗CD3和抗LY6G免疫組化染色方法觀察白質(zhì)區(qū)域外周血液來源的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況;提取胼胝體mRNA及總蛋白,分別采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-timequantitativePCR,rt-qPCR》和westernblot方法檢測(cè)致炎因子I

11、L-1[3、TNF-α、IL-6、IL-12P40以及抗炎因子IL-10的mRNA和蛋白表達(dá);免疫熒光雙標(biāo)染色觀察CystatinF在腦內(nèi)的表達(dá)及細(xì)胞定位,rt-qPCR方法檢測(cè)其mRNA和蛋白表達(dá);組間比較前述指標(biāo)以探討選擇性干預(yù)骨髓來源和非骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體活性對(duì)慢性腦血流低灌注誘導(dǎo)的白質(zhì)炎性病理反應(yīng)的影響及其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立骨髓移植細(xì)胞嵌合模型
　　(1)骨髓細(xì)胞移植前雄

12、性受體小鼠外周血白細(xì)胞性染色體為兩條帶,符合雄性染色體特征,而接受雌性小鼠骨髓細(xì)胞移植后其外周血白細(xì)胞性染色體僅為一條帶,符合雌性染色體特征,表明移植后雄性受體小鼠外周血白細(xì)胞來源于雌性供體骨髓細(xì)胞。
　　(2)骨髓細(xì)胞移植KO-WT組小鼠外周血白細(xì)胞A2A受體陽(yáng)性率(5.28％±1.05%),與KO—KO組(6.62%±2.04%)比較無(wú)顯著差異(P>0.05),而顯著低于骨髓細(xì)胞移植WT—WT組(92.32%±15.43%)(

13、P<05),表明成功建立骨髓來源細(xì)胞A2A受體選擇性缺失模型。
　　(3)骨髓細(xì)胞移植WT—KO組小鼠外周血白細(xì)胞A2A受體陽(yáng)性率(96.34%±12.58%),與WT—WT組(92.32%±15.43%)比較無(wú)顯著差異(P>0.05),而顯著高于骨髓細(xì)胞移植KO—KO組(6.62%±2.04%)Ρ<0.05),表明成功建立骨髓來源細(xì)胞A2A受體選擇性重建模型。
　　2.成功建立慢性腦血流低灌注動(dòng)物模型
　　(1)腦血

14、流監(jiān)測(cè)
　　在雙側(cè)頸總動(dòng)脈圈套前及建模后2h分別檢測(cè)腦血流量,各模型組動(dòng)物建模后腦血流量下降40%-50%,組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),表明該方法造成顯著的腦缺血,且各模型組動(dòng)物腦缺血程度相同。
　　(2)血腦屏障通透性檢測(cè)
　　分別于腦缺血后2w、4w和6w,取腦標(biāo)本ZO-1免疫組化染色,各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組動(dòng)物比較顯色強(qiáng)度評(píng)分均顯著降低(P<0.05),缺血后2w評(píng)分最低,此后逐漸升高,但至缺血后6w時(shí)仍低

15、于對(duì)照水平,表明缺血后2w血腦屏障開放最顯著,缺血后6w時(shí)血腦屏障仍處于開放狀態(tài)。
　　骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體選擇性缺失與選擇性重建動(dòng)物,以及骨髓細(xì)胞移植對(duì)照組動(dòng)物,組間比較ZO-1免疫組化染色強(qiáng)度評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);腺苷A2A受體激動(dòng)劑處理組,包括野生型和骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體選擇性重建動(dòng)物,以及載體溶液處理的對(duì)照組動(dòng)物,組間比較ZO-1免疫組化染色強(qiáng)度評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Ρ>0.05);表明腺苷A2A受體介

16、導(dǎo)的效應(yīng)對(duì)慢性腦血流低灌注造成的血腦屏障通透性變化無(wú)影響。
　　(3)白質(zhì)損傷的評(píng)價(jià)
　　分別于腦缺血后2w、4w和6w,取腦標(biāo)本Kluver-Barrera染色和Bielschowsky銀染評(píng)價(jià)白質(zhì)纖維損傷,MBP免疫組化染色評(píng)價(jià)髓鞘脫失,發(fā)現(xiàn)隨著腦缺血時(shí)間延長(zhǎng),白質(zhì)損傷逐漸加重。
　　3.干預(yù)腺苷A2A受體活性對(duì)慢性腦血流低灌注動(dòng)物認(rèn)知行為的影響
　　(1)骨髓細(xì)胞移植各組動(dòng)物的認(rèn)知行為比較
　　骨髓細(xì)

17、胞移植各組動(dòng)物,包括骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體選擇性缺失與選擇性重建動(dòng)物,以及骨髓細(xì)胞移植對(duì)照組動(dòng)物,腦缺血前組間比較Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定的平均潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)無(wú)顯著差異異>0.05),表明骨髓細(xì)胞移植對(duì)小鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力無(wú)影響,
　　(2)慢性腦血流低灌注對(duì)認(rèn)知行為的影響
　　慢性腦血流低灌注各組動(dòng)物,缺血后第4w采集的數(shù)據(jù)分別與其缺血前的數(shù)據(jù)比較,Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定的平均潛伏期延長(zhǎng)及穿越平臺(tái)次數(shù)減

18、少(P<0.05),表明腦缺血后動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力受到損害。
　　(3)骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體選擇性缺失對(duì)腦缺血引起的認(rèn)知損害的影響
　　骨髓細(xì)胞移植KO—WT組與WT-WT組比較,腦缺血后第4w,Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定的平均潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05),穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05),表明骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體的選擇性缺失,不但加重慢性腦血流低灌注造成的空間學(xué)習(xí)能力障礙,也加重記憶功能損害。
　

19、　(4)骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體選擇性重建對(duì)腦缺血引起的認(rèn)知損害的影響
　　骨髓細(xì)胞移植WT—KO組與KO—KO組比較,腦缺血后第4w,Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定的平均潛伏期顯著縮短(P<0.05),表明骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體的選擇性重建減輕慢性腦血流低灌注造成的空間學(xué)習(xí)能力損害。
　　4.干預(yù)腺苷A2A受體活性對(duì)慢性腦血流低灌注白質(zhì)損傷的影響
　　(1)干預(yù)整體腺苷A2A受體活性對(duì)慢性腦血流低灌注白質(zhì)損傷的影響

20、
　　分別于腦缺血后第2w、4w和6w,取腦標(biāo)本Kluver-Barrera染色觀察胼胝體神經(jīng)纖維損傷情況,比較發(fā)現(xiàn)腺苷A2A受體基因敲除動(dòng)物胼胝體損傷較同窩野生型動(dòng)物明顯加重,而腺苷A2A受體激動(dòng)劑CGS21680處理動(dòng)物胼胝體損傷較載體溶液對(duì)照動(dòng)物明顯減輕,表明激活腺苷A2A受體對(duì)慢性腦血流低灌注白質(zhì)損傷具有保護(hù)效應(yīng)。
　　(2)選擇性干預(yù)骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體活性對(duì)慢性腦血流低灌注白質(zhì)損傷的影響分別于腦缺血后第2w

21、、4w和6w,取腦標(biāo)本Kluver-Barrera和Bielschowsky染色評(píng)價(jià)白質(zhì)纖維損傷情況,MBP免疫組化染色評(píng)價(jià)髓鞘脫失情況。骨髓細(xì)胞移植KO—WT組與WT—WT組比較,白質(zhì)纖維損傷和髓鞘脫失更嚴(yán)重;WT—KO組與KO—KO組相比,白質(zhì)纖維損傷和髓鞘脫失明顯較輕;表明骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體的選擇性缺失加重慢性腦血流低灌注導(dǎo)致的白質(zhì)損傷,骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體介導(dǎo)的效應(yīng)減輕白質(zhì)損傷。
　　腦缺血后各時(shí)間點(diǎn),骨髓細(xì)

22、胞移植KO—WT組與KO—KO組比較白質(zhì)損傷更嚴(yán)重;腦缺血后第4w和6w,骨髓細(xì)胞移植WT→KO組與WT—WT組相比白質(zhì)損傷較輕;提示非骨髓來源細(xì)胞的腺普A2A受體介導(dǎo)的效應(yīng)對(duì)慢性腦血流低灌注導(dǎo)致的白質(zhì)損傷也產(chǎn)生影響，可能加重?fù)p傷，但對(duì)白質(zhì)損傷結(jié)局并不發(fā)揮主導(dǎo)作用。
　　腺普A2A受體激動(dòng)劑CGS21680處理各組及其載體溶液對(duì)照組動(dòng)物比較，白質(zhì)損傷嚴(yán)重程度依次為載體溶液處理的野生型動(dòng)物、載體溶液處理的骨髓來源細(xì)胞腺苷A2A受體選