慢性腦低灌注致大鼠海馬神經(jīng)血管單元相關(guān)的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突改變的研究.pdf

1、目的：慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)狀態(tài)是認(rèn)知功能受損的重要危險(xiǎn)因素之一，但其相關(guān)發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。本研究動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)大鼠在慢性腦低灌注狀態(tài)下認(rèn)知功能受損的特點(diǎn)和規(guī)律的基礎(chǔ)上，并進(jìn)一步量化分析海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞足突在微血管上的覆蓋率和星形膠質(zhì)細(xì)胞足突AQP4以及血管基底膜CollagenⅣ的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)及規(guī)律，探討CCH致實(shí)驗(yàn)大鼠認(rèn)知功能受損與膠質(zhì)血管連接和神經(jīng)血管單元(neuro

2、vascular unit，NVU)破壞的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：健康成年雄性SD大鼠96只，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組，n=44)和慢性腦低灌注組(簡(jiǎn)稱CCH組，n=52)2組，各組分別再隨機(jī)分為1周、1月、3月、6月4個(gè)亞組(CCH組各亞組分別13只大鼠，對(duì)照組各11只)。CCH組采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈法(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)建

3、立慢性腦低灌注大鼠動(dòng)物模型，對(duì)照組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其它操作均與CCH模型組相同。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別在造模后1周、1月、3月、6月分別進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、物體辨別實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠自主探索行為反應(yīng)、物體辨別和空間學(xué)習(xí)記憶能力等認(rèn)知功能，之后行腦組織病理學(xué)檢查。首先通過免疫熒光雙重染色方法標(biāo)記海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞足突AQP4和微血管基底膜CollagenⅣ共定位技術(shù)，動(dòng)態(tài)觀察1周、1月、3月、6月大鼠海馬血管旁星形膠質(zhì)細(xì)胞

4、足突、膠質(zhì)血管連接及神經(jīng)血管單元的改變;并進(jìn)一步通過透射電鏡動(dòng)態(tài)觀察1周、1月、3月、6月大鼠海馬血管旁星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、血管基底膜、膠質(zhì)血管連接、神經(jīng)血管單元超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果：(1)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1周至6月CCH模型組自主探索行為反應(yīng)較對(duì)照明顯減少(1周組2813.07±237.95vs.2401.87±191.41，1月組2628.79±366.78vs.1728.57±299.64，3月組25

5、39.14±348.67vs.2192.07±360.64，6月組2642.44±341.75vs.2202.33±459.07)，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1周組P＜0.001，1月組P＜0.001，3月組P=0.042，6月組P=0.026);物體辨別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CCH模型組大鼠物體辨別指數(shù)較對(duì)照明顯減少(1周至6月對(duì)照組vs.CCH模型組分別為1周組0.72±0.07vs0.64±0.09，1月組0.87±0.12vs.0.70±0

6、.15，3月組0.81±0.20vs.0.64±0.10，6月組0.78±0.16vs.0.61±0.07)，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1周組P=0.041，1月組P=0.015，3月組P=0.025，6月組P=0.009);水迷宮實(shí)驗(yàn)定位航行實(shí)驗(yàn)、空間探索實(shí)驗(yàn)及工作記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別顯示CCH模型組大鼠與對(duì)照組相比逃避潛伏期延長(zhǎng)，情景學(xué)習(xí)能力明顯下降(1周至6月對(duì)照組vs.CCH模型組：1周組：F(1，18)=20.61，P＜0.001，

7、1月組F(1，18)=11.82，P=0.003，3月組F(1，18)=32.48，P＜0.001，6月組F(1，18)=19.56，P＜0.001)，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，空間探索能力穿越逃生平臺(tái)次數(shù)明顯減少(1周至6月對(duì)照組vs.CCH模型組：1周組3.80±1.75vs.1.30±0.48，1月組2.8±1.14vs.1.4±1.51，3月組4.20±1.32vs.2.40±1.65，6月組3.50±1.90vs.1.30±1

8、.34)，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1周組P＜0.001，1月組P=0.031，3月組P=0.015，6月組P=0.008)，工作記憶逃避潛伏期延長(zhǎng)，記憶能力顯著降低(1周至6月對(duì)照組vs.CCH模型組：1周組：F(1，18)=29.29，P＜0.001，1月組F(1，18)=25.29，P＜0.001，3月組F(1，18)=22.34，P＜0.001，6月組F(1，18)=38.36，P＜0.001)(2)雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示：CC

9、H模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞足突在微血管上的覆蓋率明顯下降即星形膠質(zhì)細(xì)胞足突AQP4與微血管基底膜CollagenⅣ的共定位減少(1周至6月對(duì)照組vs.CCH模型組：1周組93％±0.61％vs91.64％±1.13％,1月組93.37％±1.83％vs.90.7％±1.03％,3月組91.57％±0.83％vs.88.69％±0.81％，6月組90.83％±1.33％vs.88.70％±1.63％，P＜0.05)，各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

10、1周至6月CCH模型組vs對(duì)照組：P=0.016，P=0.006，P＜0.001，P=0.020)。低灌注1周時(shí)覆蓋率開始降低，3月時(shí)降至最低，6月時(shí)稍有改善但仍未達(dá)到正常水平，CCH模型組之間相比差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(3.24)=10.85，P＜0.001);血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞足突AQP4表達(dá)量明顯降低(1周至6月對(duì)照組vs.CCH模型組2.33±1.11vs.0.76±0.33，1月組1.90±0.80vs1.12±0.42，

11、3月組2.01±0.50vs0.96±0.49，6月組2.42±1.27vs.1.71±0.99)，1周至3月各組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而6月組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1周至6月對(duì)照組vs.CCH模型組P=0.004，P=0.042，P=0.002，P=0.268)。不同時(shí)間點(diǎn)，CCH模型組之間相比差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(3，24)=3.11，P=0.044;血管基底膜CollagenⅣ表達(dá)量明顯降低(1周至6月CCH模型組vs對(duì)照組：1

12、周組6.73±0.97vs.4.76±0.88，1月組6.82±2.50vs.4.23±1.02，3月組6.57±2.28vs.3.64±1.24，6月組5.44±1.05vs.5.44±1.28)，1周至3月各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而6月組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1周至6月CCH模型組vs.對(duì)照組：P=0.002，P=0.026，P=0.012，P=0.996)。但在不同時(shí)間點(diǎn)，CCH模型組之間相比差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(3，24

13、)=3.24，P=0.040)(3)透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察顯示：從1周至6月CCH模型組大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞及其足突形態(tài)存在持續(xù)性損傷，主要表現(xiàn)在腫脹破壞，并且足突與血管基底膜分離，膠質(zhì)血管連接受損，神經(jīng)血管單元破壞。
　　結(jié)論：慢性腦低灌注可致實(shí)驗(yàn)大鼠自主探索行為反應(yīng)、物體辨別及學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能持續(xù)性受損。同時(shí)可引發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠海馬血管旁星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突AQP4持續(xù)性異常表達(dá)，及其在腦組織微血管的覆蓋率持續(xù)下降，相關(guān)神經(jīng)血管單元受