粒細胞集落刺激因子在小鼠脊髓損傷模型中對小膠質細胞的作用及其機制的研究.pdf

1、粒細胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor,G-CSF)是由單核巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞等產生的一種造血生長因子,與細胞表面的特定受體G-CSFR(CD114)結合,促進中性粒細胞系造血祖細胞生長和分化,保護中性粒細胞避免凋亡并加強它們的功能,成為防治由各種原因引起的粒細胞減少癥的有效藥物。近十年來,G-CSF在臨床上應用于骨髓移植患者,動員捐贈者骨髓中造血干細胞和間充質干細胞到受者外

2、周血中,實現(xiàn)了外周血造血干細胞的移植。目前研究發(fā)現(xiàn),G-CSF可以通過血腦屏障,具有中樞神經系統(tǒng)的保護作用,大大擴展了G-CSF的臨床應用。
　　 對中樞神經系統(tǒng)損傷的組織給予G-CSF治療能夠在損傷區(qū)域內誘導新的神經和血管形成,降低組織損害,減少梗死體積和提高神經功能。本實驗室課題組用G-CSF動員神經干細胞治療小鼠的缺血缺氧性腦損傷,而且,G-CSF能夠促進SVZ和DG等區(qū)內源性NSCs的增殖,這將為G-CSF治療神經損傷相

3、關疾病的臨床應用提供新的思路。
　　 脊髓損傷是一種嚴重危害生命健康的疾病,關于脊髓損傷的研究數(shù)不勝數(shù)。小膠質細胞(microglia,MG)作為神經系統(tǒng)具有代表性的免疫細胞,廣泛分布于中樞神經系統(tǒng),對神經元起著支持、營養(yǎng)、保護及修復等重要作用。小膠質細胞猶如一把“雙刃劍”在神經系統(tǒng)損傷、疾病等病理狀態(tài)下具有不同的形態(tài)功能和免疫活性,能夠發(fā)揮保護和破壞雙重作用。GordonS根據(jù)巨噬細胞激活的信號通路不同將其分為兩型:經典激活型

4、(M1型)和選擇激活型(M2型),兩型細胞具有不同的免疫學表型和功能。M1型細胞通過分泌不同的細胞因子促進炎癥的發(fā)生、抑制腫瘤的形成。M2型吞噬功能活躍、抑制炎癥反應、促進組織再生修復。因此,積極研究小膠質細胞對脊髓損傷的保護作用,抑制其損害作用,對脊髓損傷的修復有著重要意義。本研究主要觀察在脊髓損傷模型中G-CSF對小膠質細胞M1神經損傷型/M2神經保護型雙重角色轉化的影響,并初步探討G-CSF對小膠質細胞可能的作用機制。
　　

5、 第一部分:
　　 G-CSF對小鼠脊髓損傷后運動能力的恢復及體內小膠質細胞激活及分布的影響
　　 首先建立小鼠脊髓右側半切損傷模型,造模成功術后給予粒細胞集落刺激因子,連續(xù)3d,進行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分,評價小鼠運動功能。取脊髓切片進行免疫熒光染色檢測G-CSFR在小膠質細胞上的表達、小膠質細胞激活、募集數(shù)目和形態(tài)的變化以及灰白質內小膠質細胞分布的差異。實驗結果表明,G-CSF

6、可以促進小鼠運動功能的恢復,并激活小膠質細胞,促進小膠質細胞向損傷處募集。
　　 第二部分:
　　 G-CSF對體外脊髓損傷條件下小膠質細胞的影響
　　 免疫熒光染色和RT-PCR技術檢測BV2小膠質細胞膜上G-CSFR的表達。MTT檢測G-CSF對小膠質細胞活性的影響。利用損傷脊髓的組織上清液模擬體外脊髓損傷環(huán)境,檢測應用G-CSF后M1型/M2型小膠質細胞相關基因的表達,以及炎癥細胞因子的mRNA水平。Wes

7、ternblotting檢測應用G-CSF后小膠質細胞NF-κB信號通路p65的活性及stat3、p-stat3表達量的改變。G-CSF可以調節(jié)體外小膠質細胞M1型/M2型基因的表達,治療組M1型mRNA表達量較損傷組降低,G-CSF促進M2型mRNA表達,并延長其存在時間。G-CSF治療后IL-1β、TNFα、iNOSmRNA水平明顯降低,抗炎因子TGFβ、IL-10mRNA表達水平上升。G-CSF通過下調小膠質細胞NF-κB信號通路