粒細胞集落刺激因子通過促進腎臟分泌EPO刺激小鼠脾紅細胞生成作用的研究.pdf

1、粒細胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是體內(nèi)重要的細胞因子，能促進粒細胞生成和增強粒細胞活性，臨床上用于治療各種原因引起的粒細胞減少癥和動員造血干/祖細胞用于造血干/祖細胞移植。近期有文獻研究提示G-CSF可促進腫瘤轉移和加重腫瘤患者貧血癥狀;G-CSF動員造血干細胞之后，會造成健康捐獻者造血干細胞長時間基因表達異常;長時間使用G-CSF治療先天性粒細胞減少癥可增加患

2、白血病的概率;而我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，分泌G-CSF的乳腺癌細胞可造成小鼠紅細胞生成系統(tǒng)紊亂，骨髓紅細胞生成受到抑制，脾紅細胞生成功能增強。促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）是紅細胞生成的關鍵細胞因子，機體內(nèi)的EPO主要是由腎小管間質(zhì)細胞分泌。G-CSF是否可通過改變機體EPO水平影響造血系統(tǒng)，目前尚缺乏有效的文獻支持。研究G-CSF誘導紅細胞生成系統(tǒng)功能紊亂的機制，從不同角度評價G-CSF對機體的作用，可使我們更好

3、的理解G-CSF的藥理活性和不良反應，并有助于進一步闡明G-CSF與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關系，為G-CSF臨床合理用藥和腫瘤治療提供重要參考;同時可拓展我們對脾臟功能的認識，有利于深入理解機體紅細胞生成系統(tǒng)的調(diào)控機制。
　　目的:
　　研究粒細胞集落刺激因子(G-CSF)誘導脾臟紅細胞生成的作用機制，分析EPO在脾紅細胞生成中的功能，評價腎臟功能對脾紅細胞生成能力的影響。
　　方法:
　　1.給予C57BL/6J小鼠

4、皮下注射粒細胞集落刺激因子G-CSF，后采用FITC RatAnti-Mouse Ter119(或APC Rat Anti-Mouse Ter119)和PE Rat Anti-MouseCD71雙參數(shù)標記，流式細胞儀檢測小鼠骨髓細胞和脾細胞中Ter119和CD71雙陽性(CD71+Ter119+)細胞群體所占比例。
　　2.給予小鼠皮下注射G-CSF，采用APC Rat Anti-Mouse Ter119和Thiazoleoran

5、ge雙參數(shù)標記，流式細胞儀檢測小鼠骨髓細胞和脾臟細胞中網(wǎng)織紅細胞(Ter119+Thiazole orange+)和有核紅細胞(原紅細胞和幼紅細胞，Ter119+Thiazole orange++)占總細胞比例。
　　3.給予小鼠皮下注射G-CSF，對小鼠骨髓與外周血進行細胞涂片，采用Wright-Giemsa染色，顯微鏡下觀察。
　　4.給予皮下注射G-CSF，取小鼠脾臟細胞原代培養(yǎng)CFU-E(Colony Forming

6、Units-erythrocyte)，顯微鏡下觀察CFU-E集落形成情況。
　　5.為探究G-CSF誘導的脾臟紅細胞生成作用是否與EPO有關，給予小鼠皮下注射G-CSF，心臟取血，離心取血清，采用ELISA方法檢測小鼠血清中EPO的濃度。
　　6.給予小鼠皮下注射G-CSF，取小鼠腎臟，提取組織RNA，逆轉錄成DNA后通過RT-PCR檢測小鼠體內(nèi)腎臟組織中EPO的mRNA水平。
　　7.給予小鼠皮下注射促紅細胞生成素E

7、PO，取小鼠脾臟，制成單細胞懸液，采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+各細胞群體所占比例。
　　8.給予小鼠體內(nèi)注射EPO，取小鼠脾臟，制成單細胞懸液，Ter119/噻唑橙雙染流式檢測小鼠脾臟中Ter119+ Thiazole orange+(網(wǎng)織紅細胞)，Ter119+Thiazole orange++（原紅細胞

8、和幼紅細胞）群體所占比例。
　　9.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF的同時，給予小鼠尾靜脈輸紅細胞，采用FITC RatAnti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+細胞所占比例。采用Ter119/噻唑橙雙染流式檢測小鼠脾臟細胞，觀察網(wǎng)織紅細胞與原紅幼紅細胞所占比例。
　　10.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF的同時，給予小鼠注射EPO抗體，封閉小鼠體

9、內(nèi)EPO，后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+細胞群體所占比例。采用Ter119/Thiazole orange雙染流式檢測小鼠脾臟細胞，觀察網(wǎng)織紅細胞與原紅幼紅細胞所占比例。
　　11.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF的同時，給予小鼠喂服腺嘌呤，破壞小鼠雙腎，阻斷EPO分泌，后采用FITC Rat Anti-Mous

10、e Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+細胞群體所占比例。采用Ter119/Thiazole orange雙染流式檢測小鼠脾臟細胞，觀察網(wǎng)織紅細胞與原紅幼紅細胞所占比例。
　　12.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF，后對實驗組小鼠實施雙側腎臟切除手術，阻斷EPO來源。2天后，處死小鼠，采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE RatAnti-

11、Mouse CD71雙染法流式檢測小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+細胞群體所占比例。采用Ter119/噻唑橙雙染流式檢測小鼠脾臟細胞，觀察成熟紅細胞，網(wǎng)織紅細胞與原紅幼紅細胞所占比例。
　　13.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF，分別給藥1天、2天，取小鼠腎臟，提蛋白，采用免疫印跡法檢測在受G-CSF刺激后小鼠腎臟中缺氧誘導因子HIF-1α、HIF-2α的表達情況。
　　結果:
　　1.在給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF后，

12、小鼠股骨變白，骨髓細胞數(shù)減少，細胞中Ter119+CD71+細胞比例下降。相對應小鼠脾臟變大，顏色加深，細胞數(shù)增多，細胞中Ter119+CD71+細胞比例上升。
　　2.在給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF后，噻唑橙染色結果得出小鼠脾臟細胞Ter119+Thiazole orange+，Ter119+ Thiazole orange++群體均有顯著上升，而小鼠骨髓細胞中Ter119+ Thiazole orange+，Ter119+ Th

13、iazole orange++細胞均明顯減少。
　　3.細胞涂片結果顯示:注射了G-CSF小鼠的骨髓細胞中紅細胞數(shù)減少，粒細胞數(shù)增多。注射了G-CSF小鼠的外周血細胞涂片結果顯示:外周血中粒細胞總數(shù)增多。
　　4.原代培養(yǎng)CFU-E結果顯示，皮下注射G-CSF后小鼠脾臟細胞中CFU-E明顯增多。
　　5.ELISA測定小鼠血清中EPO結果顯示，給予小鼠G-CSF刺激以后，小鼠血清中EPO水平明顯上升。
　　6.R

14、T-PCR結果顯示，在給與小鼠G-CSF刺激后，小鼠腎臟中EPO的mRNA水平顯著上升。
　　7.檢測受G-CSF刺激的小鼠腎臟中缺氧誘導因子HIF-1α與HIF-2α表達水平。Western blot結果顯示，給與小鼠G-CSF刺激后，小鼠腎臟中缺氧誘導因子HIF-1α與HIF-2α表達水平上升。
　　8.給予小鼠外源性EPO刺激后，小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+細胞比例上升。APC Rat Anti-Mouse

15、Ter119和噻唑橙染色結果顯示脾臟細胞中Ter119+Thiazole orange+（網(wǎng)織紅細胞），Ter119+ Thiazole orange++（原紅細胞和幼紅細胞）群體均有顯著上升。
　　9.在使用G-CSF刺激小鼠后，給小鼠尾靜脈輸入紅細胞，流式檢測脾臟細胞，發(fā)現(xiàn)相比G-CSF給藥組，G-CSF給藥同時輸紅細胞組Ter119+CD71+細胞比例，Ter119+ Thiazole orange+，Ter119+ Thi

16、azole orange++細胞比例降低至正常對照組小鼠水平。
　　10.在小鼠受到G-CSF刺激的情況下，給小鼠注射一定量的EPO抗體封閉小鼠體內(nèi)EPO的功能，流式檢測脾臟細胞，發(fā)現(xiàn)Ter119+CD71+細胞比例，Ter119+Thiazole orange+，ter119+ Thiazole orange++細胞比例恢復至正常對照組小鼠水平。
　　11.在小鼠受到G-CSF刺激的情況下，同時給予小鼠喂服腺嘌呤，小鼠脾臟

17、細胞數(shù)恢復正常，流式細胞儀檢測其脾臟細胞，發(fā)現(xiàn)Ter119+CD71+細胞比例，Ter119+ Thiazole orange+，ter119+ Thiazole orange++細胞比例恢復至正常對照組水平。如果同時再給脾臟恢復正常的小鼠外源EPO刺激，脾臟再度增大，細胞數(shù)增多，Ter119+CD71+細胞比例，Ter119+ Thiazole orange+，Ter119+Thiazole orange++細胞比例再次上升。

18、　　12.給小鼠G-CSF刺激一段時間后，切除小鼠雙側腎臟，兩天后取脾臟，發(fā)現(xiàn)鼠脾臟明顯縮小，流式檢測其脾臟細胞，發(fā)現(xiàn)Ter119+CD71+細胞比例，Ter119+ Thiazole orange+，ter119+ Thiazole orange++細胞比例相比G-CSF給藥組亦明顯降低。而后再給脾臟恢復正常的小鼠外源EPO刺激，脾臟再度增大，Ter119+CD71+細胞比例，Ter119+ Thiazole orange+，Ter1