腎間質纖維化的“濁毒致瘀”病機學說及益氣化瘀解毒中藥保護作用的研究.pdf

1、目的：慢性腎臟病(CKD)在我國疾病譜中長期占據(jù)著主要的位置，嚴重危害人類的健康質量。而各類慢性腎臟病進展中均可見腎間質纖維化。當前大量的臨床及實驗結果表明腎間質纖維化程度與患者腎功能及預后密切相關。因此及時有效地減少間質的炎性細胞浸潤，減輕其導致的炎性反應，防止間質纖維化的發(fā)生與發(fā)展，這是延緩腎功能向惡化的方向進展，改善患者預后的重要手段。
　　腎間質纖維化的形成過程中腎間質炎性細胞的浸潤、炎癥性反應、腎小管足細胞受損、表型轉化

2、，腎間質成纖維細胞的活化與增殖和細胞外基質的過度沉積可導致間質瘢痕硬化的形成。而這其中炎性損傷誘導細胞增殖在腎間質纖維化進展中起著重要作用。
　　在前期研究化瘀滌痰通絡中藥調控腎上腺髓質素(Adrenomendullin, ADM)抑制細胞表型轉化的過程中，發(fā)現(xiàn)對于腎間質纖維化病變，單純抑制細胞的表型轉化尚難以減緩疾病的進展，而炎性損傷誘導細胞增殖在纖維化的形成中發(fā)揮著重要作用。結合腎病后期脾腎虧虛、濕濁毒邪內蘊的病機學說和“久病

3、入絡”的理論，發(fā)現(xiàn)梗阻性腎病存在明顯的炎性損傷和細胞增殖，基于慢性腎病后期多見“脾腎虧虛，濕濁毒邪內蘊”和“久病入絡”的病機，因而提出“濁毒致瘀”的假說。
　　本研究以單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)的方法誘導醛固酮活化—炎性介質高表達—信號轉錄—細胞增殖—細胞外基質積聚為路徑，結扎野生型(Wide Type,WT)小鼠和ADM基因敲除小鼠單側輸尿管以復制腎間質纖維化模型，同

4、時給予依普利酮和益氣化瘀解毒中藥湯劑進行研究性治療，觀察梗阻因素誘導醛固酮活化通過 SGK-1/NF-кB信號通路誘導纖維化進展，以及影響 MAPK通路中蛋白激酶 ERK(extracellular regulated protein kinases)的磷酸化，使得核轉錄因子NF-κB活化，刺激細胞增殖并分泌過多的細胞外基質形成纖維化的病理改變，以探討炎性介質(濁毒)誘導細胞增殖形成纖維化(瘀)的機制和信號傳導途徑。同時觀察ADM對細胞

5、增殖的影響以及益氣化瘀解毒中藥的調控靶點，為“濁毒致瘀”假說的提出及益氣化瘀解毒中藥的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　第一部分腎間質纖維化的“濁毒致瘀”病機學說的提出及益氣化瘀解毒中藥的保護作用
　　方法：根據(jù)有腎間質纖維化的多種腎臟慢性疾病進行到后期共同的病理過程，病癥表現(xiàn)與相應的中醫(yī)病癥的范疇匹配，查閱古代醫(yī)籍文獻，結合中醫(yī)理論、現(xiàn)代中藥藥理研究與長期臨床實踐，總結、提煉“濁毒致瘀”的實驗、臨床與治療依據(jù)，以及中醫(yī)藥在治療腎

6、間質纖維化的實驗研究和臨床應用方面的主要作用。將64例難治性腎病綜合征患者分為治療組和對照組各32例，對照組按照強的松標準療程給予；治療組在對照組基礎上加服益氣化瘀解毒中藥，持續(xù)半年以上。兩組患者在治療結束后分別觀察觀察療效、24h尿蛋白定量(URPO)、血清白蛋白(ALB)、總膽固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)血纖維蛋白原(FIB)及部分凝血酶原時間(APTT)的變化。
　　結果：總結并提出了腎間質纖維化的“濁毒致瘀”病機學說

7、，同時針對“濁毒致瘀”的病機，確立益氣化瘀解毒治法，在實驗研究和臨床應用中初識益氣化瘀解毒中藥對于腎間質纖維化的保護作用機制。兩組治療前后自身比較，治療組24h尿蛋白、膽固醇、甘油三酯及血纖維蛋白原較治療前顯著降低（P<0.05），而血清白蛋白和部分凝血酶原時間較治療前明顯升高（P<0.05）；對照組24h尿蛋白、膽固醇及血纖維蛋白原較治療前顯著降低（P<0.05），而血清白蛋白和部分凝血酶原時間較治療前明顯升高（P<0.05）；兩組治

8、療后比較，治療組24h尿蛋白、膽固醇、甘油三酯及血纖維蛋白原較對照組顯著降低(P<0.05），而血清白蛋白和部分凝血酶原時間較對照組明顯升高（P<0.05）。
　　第二部分腎上腺髓質素基因敲除小鼠的繁殖與鑒定
　　方法：選用 C57BL/6純系雌性野生小鼠和腎上腺髓質素基因敲除小鼠按照SPF(無特定病原體)級動物飼養(yǎng)標準進行飼養(yǎng)。適應性喂養(yǎng)結束后，將1只雄鼠和2只雌鼠合籠進行繁殖。雜交繁殖后經(jīng)基因鑒定篩選出的三個月齡雄性腎上

9、腺髓質素基因敲除雜合子小鼠與純系雌性野生小鼠合籠，待實驗小鼠成熟后分組繁殖，雌性小鼠一旦懷孕立即記錄父系來源并分籠。提取小鼠尾部組織DNA基因組，通過PCR進行擴增，而后進行2％瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定并篩選出本實驗所用ADM基因敲除小鼠。
　　結果：小鼠尾部組織瓊脂糖凝膠電泳基因型片段顯示ADM基因敲除小鼠基因型雜合子(+/-)為雙道，按此類基因條帶可以鑒別出腎上腺髓質素(ADM)基因敲除小鼠。
　　第三部分益氣化瘀解毒中藥

10、對野生型和ADM基因敲除型腎間質纖維化小鼠腎臟組織形態(tài)學、醛固酮及細胞增殖的影響
　　方法：野生型(WT)及ADM基因敲除型(AMKO)小鼠全部采取隨機分組， WT型小鼠四組分別為假手術組(WT-Sham group)、模型組(WT-UUO group)、依普利酮組(WT-UUOE group)及中藥治療組(WT-UUOZ group)四組；AMKO型小鼠四組分別為假手術組(AMKO-Sham group)、模型組(AMKO-UU

11、O group)、依普利酮組(AMKO-UUOE group)及中藥治療組(AMKO-UUOZ group)四組。以上各組僅假手術組采用切開并游離左側輸尿管但不結扎的方法，其余的各組則施以左側輸尿管結扎術。兩中藥治療組給予益氣化瘀解毒中藥湯劑(黃芪20g、丹參20g、醋鱉甲、僵蠶、烏梢蛇、地龍、赤芍、黃芩、金銀花、蒲公英、大黃各10g，以上藥物按照成人一日劑量50kg體重一日用量折算)6.5g/kg?d以口灌服；兩個依普利酮治療組則采用

12、依普利酮混勻于飼料后按照100mg/kg?d劑量進食。兩假手術組和兩模型組通過經(jīng)口灌服與中藥治療組中藥湯劑等劑量的生理鹽水。連續(xù)觀察實驗各組小鼠的一般情況，給藥持續(xù)10天。在實驗結束時，采用小鼠眼球摘除取血，在使用離心機分離血清后，分別測定小鼠的血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、醛固酮(Ald)；摘取左側腎臟，進行腎臟組織HE、MASSON染色，觀察組織病理學改變；采用免疫組化法檢測各組小鼠腎臟中PCNA的表達。
　　以上數(shù)據(jù)資

13、料均以均數(shù)±標準差(mean±S.D.)表示，使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，采用單因素方差分析(ANOVA)和卡方檢驗(Chi-square test)分析。差異水平以0.05和0.01做為檢驗標準。
　　結果：
　　1實驗小鼠一般情況觀察結果
　　實驗過程中，兩假手術組小鼠飲食飲水情況與其余各組無明顯異常，手術切口均愈合良好。實驗結束時，摘取各組小鼠左側腎臟，觀察顯示兩假手術組小鼠腎臟形態(tài)顏色均與正常小鼠一致

14、，兩模型組可見腎臟體積明顯增大伴有積水，顏色由正常的鮮紅色變?yōu)辄S色，甚則暗褐色：兩依普利酮組和中藥組腎臟體積也有增大，但較模型組相對較小，積水量少，顏色呈現(xiàn)暗紅色。
　　2小鼠腎組織病理形態(tài)學檢測結果
　　HE染色顯示，兩型小鼠的假手術組均未觀察到明顯的異常。WT和AMKO兩型小鼠模型組可見明顯的腎小管上皮細胞的水腫，變性壞死以及缺失，有的萎縮程度較甚，在腎間質區(qū)可觀察到有大量的炎性細胞的浸潤，ADM基因敲除小鼠模型組尤甚。

15、兩型小鼠的依普利酮治療組及中藥治療組的病理損傷程度與模型組比較減輕，同時可見基因敲除小鼠損傷重于野生小鼠。Masson染色結果可見，WT小鼠與AMKO小鼠的假手術組腎臟結構基本正常，僅有少量膠原成分出現(xiàn)于腎間質，腎小管的基底膜具有較好的完整性。WT和AMKO小鼠模型組的腎臟結構被破壞，腎小管基底膜嚴重變薄，同時可見有部分小管呈現(xiàn)出擴張現(xiàn)象，膠原成分以條帶樣或灶狀大量沉積于腎間質，AMKO型小鼠的損傷重于WT型小鼠。兩型小鼠的依普利酮治療

16、組及中藥治療組腎間質膠原成分的聚集較模型組均有明顯減輕的趨勢。
　　3腎功能檢測結果
　　BUN檢測結果顯示，野生小鼠與 ADM基因敲除小鼠模型組與同類型小鼠假手術組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠的依普利酮治療組和中藥治療組與同類型小鼠模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，野生小鼠中藥治療組與ADM基因敲除小鼠的中藥治療組比較有差異(P<0.05)。Scr檢測結果顯示，野生小鼠與ADM基因敲

17、除小鼠模型組與同類型小鼠假手術組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠的依普利酮治療組和中藥治療組與同類型小鼠模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，野生小鼠中藥治療組與ADM基因敲除小鼠的中藥治療組比較有差異(P<0.05)。
　　4醛固酮檢測結果
　　Ald檢測結果顯示，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠模型組與同類型小鼠假手術組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠的依普利酮治

18、療組和中藥治療組與同類型小鼠模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，野生小鼠依普利酮組與ADM基因敲除小鼠依普利酮治療組比較有差異(P<0.05)，野生小鼠中藥治療組與ADM基因敲除小鼠的中藥治療組比較有差異(P<0.05)。
　　5對細胞增殖的影響
　　PCNA檢測結果顯示，在假手術組的小鼠腎小管上皮細胞中觀察到極少數(shù)目的PCNA陽性細胞，而在UUO小鼠的遠端腎小管其表達顯著增加。與UUO小鼠相比，PCNA陽性細胞在兩個依

19、普利酮治療組及中藥組中均減少。與WT小鼠相比，陽性細胞的數(shù)目在ADM基因敲除小鼠的模型組、依普利酮處理組及中藥組中明顯增加。其中，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠模型組與同類型小鼠假手術組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠的依普利酮治療組和中藥治療組與同類型小鼠模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，野生小鼠依普利酮組與ADM基因敲除小鼠依普利酮治療組比較有差異(P<0.05)，野生小鼠中藥治療組與ADM基因敲除

20、小鼠的中藥治療組比較有差異(P<0.05)。
　　第四部分益氣化瘀解毒中藥對野生型和ADM基因敲除型腎間質纖維化小鼠SGK-1、NF-кB(P65)、ERK、P-ERK及ADM的影響
　　方法：動物分組情況、模型制作及給藥方法與第二部分相同，實驗過程共10天。實驗結束后摘取小鼠的左側腎臟，采用Western-Blot和免疫組化法對各組小鼠腎臟SGK-1、NF-кB(P65)、ERK、P-ERK及ADM的表達進行檢測。統(tǒng)計學方

21、法同第二部分。
　　結果：
　　1 Western Blot檢測SGK-1、NF-кB、ERK、P-ERK及ADM的表達
　　1.1 Western Blot檢測SGK-1的表達
　　應用Western Blot檢測SGK-1蛋白表達情況，半定量結果顯示，野生及 ADM基因敲除兩假手術組小鼠腎組織 SGK-1有表達極少，兩模型組表達明顯高于同型小鼠的假手術組(P＜0.05)，AMKO模型組的表達高于WT小鼠模型組

22、(P＜0.05)。兩型小鼠的依普利酮治療組和中藥治療組相較于同型小鼠模型組降低顯著(P＜0.05)。WT小鼠和AMKO小鼠同種處理方法組間比較，AMKO型小鼠中藥治療組和依普利酮治療組與WT型小鼠兩處理組間無明顯差異(P均>0.05)。
　　1.2 Western Blot檢測NF-кB的表達
　　應用Western Blot檢測NF-кB蛋白表達情況，半定量結果顯示，WT及AMKO兩型假手術組小鼠腎組織NF-кB表達量極少

23、，兩型小鼠的模型組表達增強，較同型假手術組明顯升高(P＜0.05)，AMKO模型組 NF-кB的表達高于WT小鼠模型組(P＜0.05)。兩型小鼠的依普利酮治療組和兩中藥治療組均低于同型小鼠的模型組(P＜0.05)。WT小鼠和AMKO小鼠同種處理方法組間比較，AMKO型小鼠的中藥治療組和依普利酮治療組與WT型小鼠的兩處理組存在明顯差異(P均＜0.05)。
　　1.3 Western Blot檢測P-ERK的表達
　　應用Wes

24、tern Blot檢測P-ERK蛋白表達情況，半定量結果顯示，WT及AMKO假手術組小鼠的P-ERK表達量極少，WT和AMKO小鼠的模型組表達增強，顯著高于同種類型小鼠的假手術組(P＜0.05)，同時可見到AMKO的模型組高于WT小鼠模型組(P＜0.05)。兩型小鼠的依普利酮治療組及兩中藥治療組P-ERK的表達低于同類型的小鼠模型組(P＜0.05)。WT型小鼠和AMKO型小鼠同種處理方法組間比較，AMKO型小鼠的中藥治療組和依普利酮治療

25、組與 WT型小鼠兩處理組間存在明顯差異(P均＜0.05)。
　　1.4 Western Blot檢測P-ERK/ERK的表達
　　應用Western Blot檢測ERK蛋白表達情況，后將P-ERK與ERK進行比值處理，結果顯示W(wǎng)T及AMKO小鼠P-ERK/ERK在模型組中上升，明顯高于同類型小鼠的假手術組(P＜0.05)，同時發(fā)現(xiàn)AMKO小鼠模型組高于WT小鼠模型組(P＜0.05)。兩型小鼠依普利酮治療組和中藥治療組則低于同

26、種類型小鼠的模型組(P＜0.05)。WT型小鼠和AMKO型小鼠同種處理方法組間比較，AMKO型小鼠的中藥組和依普利酮組與WT型小鼠兩處理組不存在明顯差異(P均>0.05)。
　　1.5 Western Blot檢測ADM的表達
　　應用Western Blot檢測ADM蛋白表達情況，半定量結果顯示，野生及ADM基因敲除兩假手術組小鼠腎組織ADM蛋白大量表達，兩模型組表達顯著低于同型假手術組(均有 P＜0.01)，同時可見 A

27、DM基因敲除模型組低于野生小鼠模型組(P＜0.05)。野生假手術組明顯高于ADM基因敲除假手術組(P＜0.05)，兩型小鼠的依普利酮治療組和中藥治療組明顯高于同類型模型組(P＜0.05)。WT及AMKO小鼠同型之間中藥組與依普利酮組不存在差異(P均>0.05)。WT小鼠依普利酮組與 AMKO小鼠依普利酮治療組比較有差異(P<0.05)，WT小鼠中藥治療組與AMKO小鼠的中藥治療組比較有差異(P<0.05)。
　　2免疫組化檢測SG

28、K-1、NF-кB及P-ERK的表達
　　2.1免疫組化檢測SGK-1的表達
　　光鏡觀察結果顯示，WT及AMKO假手術組小鼠的SGK-1基本無陽性表達，在腎小球、小管和間質部無表達；兩型小鼠的模型組中 SGK-1在集合管的上皮細胞胞質中呈現(xiàn)增多的趨勢，有些腎小管的上皮細胞以及周圍的間質區(qū)域中SGK-1表達顯著，AMKO模型組表達尤其明顯。兩型小鼠的依普利酮治療組及中藥治療組SGK-1表達較同型模型組明顯減少。
　　2

29、.2免疫組化檢測NF-кB的表達
　　光鏡下WT及AMKO假手術組小鼠陽性表達基本不可見，在腎小球、小管及間質部亦無表達；WT和AMKO兩型小鼠的模型組中NF-кB在腎皮質的近端小管的細胞質中表達出現(xiàn)明顯的增多，其中尤其以AMKO模型組表達較為明顯。兩類型小鼠的依普利酮治療組及中藥治療組 NF-кB表達較同型模型組明顯減少。
　　2.3免疫組化檢測P-ERK的表達
　　WT和AMKO假手術組小鼠P-ERK極少表達，僅存

30、在于腎小球和小管處；WT及AMKO模型組的表達可見于腎小管的上皮細胞，髓質區(qū)表達明顯增強，ADM基因敲除小鼠尤其明顯；WT和AMKO的依普利酮治療組與中藥治療組的表達相對于同類型小鼠的模型組顯著減少。但兩組中ADM基因敲除小鼠較野生小鼠損傷更為嚴重。
　　結論：
　　1“濁毒致瘀”是慢性腎臟病的重要病機。
　　2 梗阻性腎病可激活醛固酮，誘導炎癥損傷，刺激細胞增殖，參與腎間質纖維化。
　　3 ADM參與腎間質纖維