DFFA和PSMC3在RNA干擾功能中的調(diào)控作用.pdf

1、目的：
　　 RNA干擾是一種由siRNA或dsRNA介導(dǎo)的基因沉默表達(dá)的方式。通過與靶mRNAde特異性結(jié)合，這些小RNA與Argonaute(AGO)蛋白及相關(guān)因子形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，后者完成對靶mRNA的剪切或者翻譯抑制。前面通過酵母雙雜交篩選出與人類Argonaute2(Ago2)相關(guān)蛋白--DFFA和PSMC3，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過免疫共沉淀驗(yàn)證它們與Ago2相互作用的特異性，通過熒光實(shí)驗(yàn)，

2、我們推測這兩種蛋白在體內(nèi)miRNA或者siRNA介導(dǎo)的mRNA剪切中發(fā)揮著重要功能。
　　 方法：
　　 利用免疫共沉淀的方法在細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證DFFA、PSMC3同人類Ago2蛋白之間相互作用的特異性，通過GST pull-down驗(yàn)證DFFA同Argonaute2 PIWI結(jié)構(gòu)域(hAgo2 PIWI)體外結(jié)合作用。構(gòu)建內(nèi)源性miR-21介導(dǎo)的GFP陽性Read-Out報(bào)告系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)驗(yàn)證在分別敲除DFFA和PSMC3

3、的情況下，被抑制的GFP表達(dá)效果是否得以增強(qiáng)；利用siRNA-GFP和表達(dá)GFP的質(zhì)粒作為研究siRNA介導(dǎo)的GFP表達(dá)抑制，觀察在分別敲除DFFA和PSMC3的情況下GFP的表達(dá)強(qiáng)度變化，間接推測兩者在由小RNA介導(dǎo)的RNA干擾過程中的功能。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫共沉淀證實(shí)外源性DFFA和PSMC3同轉(zhuǎn)染的hAgo2 PIWI存在著特異的相互作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，DFFA和PSMC3 Flag融合蛋白的N端結(jié)

4、構(gòu)域可能與全長的hAgo2蛋白相互結(jié)合。
　　 2.通過GST-pull down體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)DFFA同hAgo2 PIWI的相互作用。
　　 3.敲除了DFFA、PSMC3對miR-21介導(dǎo)的內(nèi)源封閉報(bào)告系統(tǒng)產(chǎn)生的積極地作用。
　　 4.敲除了DFFA、PSMC3對si-GFP介導(dǎo)的GFP抑制產(chǎn)生了逆轉(zhuǎn)的效果。
　　 結(jié)論：
　　 DFFA在體內(nèi)、體外均同hAgo2 PIWI存在著相互作用，