AGO2相互作用蛋白PSMC3、DFFA對RNAi功能的影響.pdf

1、目的:
　　RNAi是生物體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)的重要方式。外源性的dsRNA、siRNA和內(nèi)源性的miRNA均可以做作為RNAi的觸發(fā)器，可以對同源靶RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生強大且特異性的剪切或抑制表達(dá)作用。RISC作為RNAi的效應(yīng)器，發(fā)揮靜默mRNA的作用。人類Argonaute2蛋白是人類Argonaute蛋白家族中已知的唯一在RNAi起作用的成員，是RISC的核心成分之一，與siRNA即可構(gòu)成最簡單的效應(yīng)器發(fā)揮剪切靶mRNA的作用

2、。本實驗室在前期工作中利用酵母雙雜交系統(tǒng)從人類肺cDNA文庫中篩選得到了一系列可能與人類Argonaute2蛋白PIWI結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白，本文在前期工作的基礎(chǔ)上選擇了其中兩個蛋白DFFA、PSMC3進(jìn)行深入研究，對其與Argonaute2蛋白的相互作用進(jìn)行進(jìn)一步驗證，并研究了這兩個蛋白對RNAi的影響，以期進(jìn)一步深入了解RNAi的機制、探索RNAi可能的調(diào)控機制，為RNAi在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　選

3、擇本實驗室在前期工作中利用酵母雙雜交系統(tǒng)從人類肺cDNA文庫中篩選得到的可能與人類Argonaute2蛋白PIWI結(jié)構(gòu)域相互作用的兩個蛋白DFFA、PSMC3，利用免疫熒光技術(shù)，觀察DFFA、PSMC3與AGO2蛋白在A549細(xì)胞內(nèi)的共定位。通過分別轉(zhuǎn)染DFFA、PSMC3表達(dá)質(zhì)粒和特異性siRNA干擾DFFA、PSMC3的表達(dá)來研究在活細(xì)胞內(nèi)這兩個蛋白對RNAi的影響。通過體外轉(zhuǎn)錄生成靶mRNA，利用細(xì)胞提取物來實現(xiàn)對靶mRNA的體外

4、剪切，研究在細(xì)胞外這兩個蛋白對RNAi的影響。
　　結(jié)果:
　　1.免疫熒光證明DFFA、PSMC3與內(nèi)源性、外源性轉(zhuǎn)染的AGO2蛋白共定位于細(xì)胞漿中。
　　2.DFFA、PSMC3的過表達(dá)在siRNA量為100nM時對RNAi的影響不明顯，DFFA、PSMC3的過表達(dá)在siRNA量為50nM時對RNAi有促進(jìn)作用，用特異性siRNA干擾DFFA、PSMC3的表達(dá)可以抑制RNAi的效果。
　　3.通過體外剪切靶m

5、RNA，證實了DFFA、PSMC3的過表達(dá)對RNAi的影響不明顯，特異性siRNA干擾DFFA、PSMC3的表達(dá)可以抑制RNAi的效果。
　　結(jié)論:
　　免疫熒光技術(shù)證實了細(xì)胞內(nèi)DFFA、PSMC3與AGO2蛋白存在共同定位，DFFA、PSMC3可以通過與AGO2的相互作用影響RNAi，DFFA、PSMC3的過表達(dá)在siRNA飽和時對RNAi的影響不明顯，DFFA、PSMC3的過表達(dá)在siRNA不飽和時可以促進(jìn)RNAi的效果