核酸載體精胺化普魯蘭在抗腫瘤RNA干擾中的作用研究.pdf

1、目的:RNA干擾(RNAi)技術(shù)在多種蛋白表達(dá)相關(guān)的疾病或病毒感染的治療中具有應(yīng)用前景。實(shí)現(xiàn)RNAi的關(guān)鍵條件之一是獲得具有RNA藥物高裝載量和高轉(zhuǎn)染效率、無毒且無免疫原性、并易于商業(yè)化生產(chǎn)的載體。非病毒型載體具有易化學(xué)合成、低免疫原性、保護(hù)siRNA免于降解等優(yōu)勢。在眾多非病毒載體中，陽離子多糖具有良好的生物相容性并且易修飾，一直是核酸載體的研發(fā)重點(diǎn)之一。但是，在遞送siRNA過程中，陽離子多糖會與血清蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，從而影響R

2、NA干擾效率。為了減少血清蛋白的影響，通常需要使用無血清條件培養(yǎng)細(xì)胞。然而，在無血清環(huán)境中，陽離子多糖又會通過靜電相互作用而與細(xì)胞膜發(fā)生非特異性結(jié)合，由此而導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞毒性;此外，當(dāng)在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，無血清環(huán)境的要求也無法中得到滿足。
　　慢性髓系白血病(CML)是由造血干細(xì)胞染色體移位而產(chǎn)生融合基因BCR-ABL所導(dǎo)致的血液惡性腫瘤。CML的主要治療方法為激酶抑制劑和異體造血干細(xì)胞移植，但患者會逐漸對激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥，同時(shí)還有部

3、分患者對藥物不耐受。越來越多的研究致力于將RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于CML的治療，但是，面臨著CML細(xì)胞難以轉(zhuǎn)染的挑戰(zhàn)。目前對CML細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法主要包括電穿孔和病毒載體兩種。但是，電穿孔轉(zhuǎn)染不能用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，而病毒載體具有引起免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，并且易引起宿主基因突變，因此，迫切需要研發(fā)針對CML細(xì)胞的新型載體。
　　精胺化普魯蘭多糖（Pullulan-spermine，Ps）是一種典型的陽離子多糖，由于其特有的化學(xué)成分而在肝臟細(xì)胞的RN

4、Ai中得到廣泛研究。實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中的血清濃度會影響Ps與siRNA所形成的復(fù)合物(Ps/siRNA)被乳腺癌細(xì)胞攝取的數(shù)量及其溶酶體逃逸能力，由此而影響RNA干擾效率，但是關(guān)于血清蛋白(Pr)與Ps的相互作用及Pr與Ps的質(zhì)量比(Pr/Ps)與RNAi之間的關(guān)系尚需要深入研究。此外，尚未有研究報(bào)道Ps在血液惡性腫瘤RNAi中的應(yīng)用。本研究用Ps作為模型陽離子多糖載體，開展以下兩方面的研究:(1)Ps對蛋白分子的吸附作

5、用以及Pr/Ps對Ps/siRNA復(fù)合物的粒徑和RNA干擾效率的調(diào)控作用;(2)以Ps為siRNA載體，沉默CML細(xì)胞功能基因BCR-ABL，并比較Ps在CML細(xì)胞、RAW264.7和Jurkat細(xì)胞上引起的RNA干擾效率的差異。
　　方法:采用等溫滴定量熱法研究Ps與牛血清白蛋白(BSA)之間的吸附作用，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測Ps/siRNA復(fù)合物的形成，以及BSA對Ps與siRNA結(jié)合穩(wěn)定性的影響;通過動態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)(DLS)

6、研究溶液體系中Pr/Ps對Ps/siRNA復(fù)合物顆粒尺寸的影響。以MDA-MB-231和MDA-MB-231-EGFP細(xì)胞為模型，用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微術(shù)檢測Pr/Ps對復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的影響和對RNA干擾效率的影響。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)研究血清對Ps、Lipo3000介導(dǎo)β-actin/BCR-ABL siRNA對K562、KU812、MEG-01、RAW、Jurkat細(xì)胞的RNA干擾效率的影響;以Ps/PGL4.51轉(zhuǎn)染K562

7、、RAW、Jurkat細(xì)胞，并用微孔板塊熒光檢測儀檢測Luc的表達(dá)量。
　　結(jié)果:Ps與siRNA完全結(jié)合的質(zhì)量比為0.75∶1。在溶液中Ps會吸附BSA分子，但BSA的吸附不影響Ps/siRNA的穩(wěn)定性。在一定siRNA質(zhì)量范圍內(nèi)，隨著Pr/Ps的增大，Ps/siRNA的粒徑減小，同時(shí)，復(fù)合物Ps/siRNA進(jìn)入細(xì)胞的能力、對細(xì)胞的毒性和介導(dǎo)基因沉默的效率也逐漸降低;在Pr/Ps固定的條件下，隨siRNA量的增加，RNA干擾效率

8、逐漸提高，當(dāng)siRNA濃度達(dá)到1μg/mL后，RNA干擾效率不再增加。在Ps/siRNA與細(xì)胞共孵育后，使用氯喹(CQ)處理細(xì)胞，可使RNA干擾效率進(jìn)一步提高。
　　當(dāng)N/P為2.5時(shí)，復(fù)合物Ps/siRNA的粒徑不受培養(yǎng)基中血清濃度的影響。同時(shí)，無論在無血清培養(yǎng)基中還是在有血清培養(yǎng)的條件下，K562的細(xì)胞活性都在80％以上;Ps/FAM-siRNA在3種CML細(xì)胞上的陽性率均大于95％，而在RAW和Jurkat兩種細(xì)胞上的陽性率

9、在85％左右。
　　對5種細(xì)胞的β-actin基因進(jìn)行RNA干擾，在Opti-MEM培養(yǎng)基條件下，Ps在3種CML細(xì)胞上介導(dǎo)的干擾效率高于Lipo3000，在RAW、Jurkat細(xì)胞上低于Lipo3000;在10％的血清濃度條件下，Lipo3000和Ps介導(dǎo)的干擾效率均很低。對3種CML細(xì)胞的BCR-ABL基因進(jìn)行RNA干擾，在上述兩種培養(yǎng)基條件下，載體Ps在K562細(xì)胞上介導(dǎo)的干擾效率明顯高于Lipo3000;對于KU812細(xì)胞

10、，Ps與Lipo3000介導(dǎo)的干擾效率沒有差異;對于MEG-01細(xì)胞，在Opti-MEM培養(yǎng)基條件下，Ps介導(dǎo)的干擾效率高于Lipo3000，而在10％血清濃度條件下，低于Lipo3000。
　　當(dāng)N/P為2.5時(shí)，Ps在K562及其耐藥株上介導(dǎo)的RNA干擾效率不受血清濃度影響，但在HELA細(xì)胞上介導(dǎo)的干擾效率則隨血清濃度的增加而降低。此外，Ps/PGL4.51在K562細(xì)胞上介導(dǎo)的熒光素酶的表達(dá)量高于在RAW和Jurkat細(xì)胞上