柄區(qū)肽和腎素(前體)受體干擾對腎素前體激活的P13K-AKT信號通路的影響.pdf

1、背景：
　　 動脈粥樣硬化(AS)是嚴重影響人類的健康的主要疾病。其機理的研究已進行了數(shù)十年。目前一致認為，炎癥反應和內(nèi)皮功能紊亂對AS的形成和發(fā)展起著關鍵作用。許多危險因素可激活一些信號通道蛋白和炎癥因子，導致內(nèi)皮功能異常。其中腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的效應因子血管緊張素Ⅱ(Ang H)在動脈粥樣硬化中起著重要作用。過去認為，腎素發(fā)揮酶活性使血管緊張素原轉(zhuǎn)變成Ⅰ(AngⅠ)，除此之外無其他生物學效應。腎素前體則被視為無活性

2、的腎素的前體。近年來，隨著腎素（前體）受體[(pro)renin receptor，(P)RR]的發(fā)現(xiàn)，對腎素前體的功能有了再認識。一些研究表明，腎素和腎素前體通過與(P)RR結(jié)合，可發(fā)揮不依賴于AngⅡ的生物學作用，使腎系膜細胞增殖，平滑肌細胞遷移等作用。本實驗組前期實驗用免疫組化的方法首次發(fā)現(xiàn)(P)RR在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中也有表達。于是，我們推測腎素（前體）及其受體在血管內(nèi)皮細胞中可能存在與腎系膜細胞及心肌細胞類似的病

3、理生理作用。
　　 腎素前體前肽，即柄區(qū)肽(handle region peptide， HRP)，是一段人工合成的含有10個氨基酸的肽片段，影響腎素前體與(P)RR的結(jié)合，因此HRP被認為是(P)RR阻滯劑。但是目前對HRP作為(P)RR阻斷劑的研究結(jié)果存在矛盾。本實驗將通過成倍增加HRP作用濃度，觀察HRP能否阻斷(P)RR，對內(nèi)皮細胞起到保護性作用。
　　 PI3K\AKT信號通路能直接磷酸化多種細胞因子，如NFκ

4、B、Bcl-2、TGF-β等，與血管壁細胞表型轉(zhuǎn)換、增殖、遷移和肥大有關。因此，PI3K\AKT信號通路可能參與腎素前體及其受體的作用機制。
　　 目的：
　　 觀察在離體培養(yǎng)的HUVEC中，腎素前體能否不依賴于AngⅡ并通過(P)RR來影響細胞中PI3K\AKT，NFκB蛋白以及炎癥因子IL-6的表達；并觀察HRP是否存在(P)RR阻斷功能。
　　 方法：
　　 1．體外培養(yǎng)原代HUVECs。
　

5、　 2．予奧美沙坦(10-5M)和PD123319(10-4M)分別阻斷HUVECs血管緊張素Ⅱ受體AT1、AT2，觀察腎素前體(2×10-9M)對細胞中PI3K，p-AKT，NFκB-P65蛋白以及細胞上清液中炎癥因子IL-6的影響。
　　 3．分別以(P)RR-siRNA干擾細胞(P)RR，以及三種濃度的HRP(1×10-6M，5×10-6M，10×10-6M)作用于細胞，觀察各自對腎素前體引起的AKT、NFκB-P65蛋

6、白以及IL-6激活的影響。
　　 4．予Wortmannin(0.5×10-6M)阻斷PI3K\AKT信號通路，觀察wortmannin對腎素前體引起的AKT、NFκB-P65蛋白以及IL-6激活的影響。
　　 5.(P)RR干擾效率通過RT-PCR檢測。
　　 6.PI3K，p-AKT，p65蛋白通過western-blot檢測。
　　 7．細胞上清液中IL-6的濃度用ELISA試劑盒檢測。
　　

7、 結(jié)果：
　　 1．腎素前體可以上調(diào)PI3K，P-AKT，P65蛋白和炎癥因子IL-6的表達。
　　 2．三種HRP濃度均不能抑制腎素前體引起的AKT，P65蛋白和炎癥因子IL-6激活。
　　 3.(P)RR干擾可以抑制腎素前體引起的AKT，P65蛋白和炎癥因子IL-6激活。
　　 4．腎素前體引起的P65和IL-6表達增加不能被wortmannin所抑制。
　　 結(jié)論：
　　 1．腎素