氫氣通過P13K-Akt信號(hào)通路抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡.pdf

1、隨著近年來臨床手術(shù)中冠脈溶栓術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)等微創(chuàng)手術(shù)的發(fā)展，術(shù)后早期并發(fā)癥的防治成為時(shí)下研究的熱點(diǎn)，而其中最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥—心肌缺血再灌注(ischemic reperfusion，I/R)損傷越來越受到人們的關(guān)注。糖尿病(diabetic mellitus DM)是一種臨床常見的慢性疾病，流行病學(xué)和臨床研究顯示，糖尿病人群中缺血性心臟病的發(fā)生率及嚴(yán)重程度遠(yuǎn)高于非糖尿病人群。目前，人們將更多得將目光放在糖尿病對(duì)心肌缺血

2、再灌注損傷的影響上。近年來大量研究表明，氫氣是一種重要的生理性調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞和器官水平上，具有明確的選擇性抗氧化、抗炎癥和抗細(xì)胞凋亡等臟器保護(hù)作用，本研究復(fù)制糖尿病大鼠模型，觀察氫氣腹腔注射對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為糖尿病患者圍術(shù)期處理提供理論依據(jù)。
　　第一部分:氫氣對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:觀察氫氣對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡及

3、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　方法:以鏈脲佐菌素復(fù)制糖尿病模型，造模成功后繼續(xù)高糖喂養(yǎng)4周作心肌I/R損傷模型。60只成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量300-350克，隨機(jī)數(shù)字表法分非糖尿病假手術(shù)對(duì)照組(NS)，非糖尿病I/R組(NI/R)，非糖尿病氫氣治療組(NH)，糖尿病假手術(shù)對(duì)照組(DS)，糖尿病I/R組(DI/R)，糖尿病氫氣治療組(DH)，每組10只。假手術(shù)組只穿線包繞冠狀動(dòng)脈左前降支不接扎，I/R組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30mi

4、n后松開行再灌注120min制備心肌I/R損傷模型。氫氣治療組于再灌注同時(shí)腹腔注射99.6％濃度5ml/kg的氫氣。再灌注120min后，采集動(dòng)脈血利用分光光度計(jì)法測(cè)血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)活性，同時(shí)采用免疫組化法測(cè)定各組心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase3表達(dá)水平。原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)心肌凋亡細(xì)胞并計(jì)算凋亡指數(shù)。
　　結(jié)果:糖尿病大鼠心肌I/R后血漿LDH、CK-MB水平明顯高于

5、非糖尿病大鼠(P＜0.01)，同時(shí)Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白的表達(dá)水平及凋亡細(xì)胞指數(shù)均明顯增高(P＜0.01)，與I/R組相比，氫氣治療各組血漿LDH、CK-MB和凋亡細(xì)胞指數(shù)水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞百分率明顯升高(P＜0.01)，Bax、Caspase3蛋白陽性細(xì)胞百分率及凋亡細(xì)胞指數(shù)均明顯降低(P＜0.01)。
　　結(jié)論:氫氣腹腔注射對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能通過上調(diào)Bcl-2

6、蛋白表達(dá)和下調(diào)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　第二部分:PI3K/Akt信號(hào)通路在氫氣抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡中的作用
　　目的:研究PI3K/Akt信號(hào)通路與氫氣抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系。方法:以鏈脲佐菌素復(fù)制糖尿病模型，造模成功后繼續(xù)高糖喂養(yǎng)4周作心肌班瀕傷模型。50只SD大鼠進(jìn)行糖尿病造模，造模成功40只，再根據(jù)“隨機(jī)數(shù)字表法”分成4組，分

7、別為糖尿病假手術(shù)組(DS組)、糖尿病心肌缺血再灌注組（DI/R組）、糖尿病心肌缺血再灌注氫氣治療組（DH組）、糖尿病心肌缺血再灌注氫氣治療+LY294002組（DH+LY294002組），每組各10只。采用結(jié)扎大鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支建造大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，再灌注同時(shí)給予腹腔注射氫氣，LY294002于注射氫氣前經(jīng)鼠尾靜脈注入。免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞Bad表達(dá)水平，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcript

8、ion PCR，RT-PCR)檢測(cè)心肌細(xì)胞pAktmRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:與DS組比較，DI/R組、DH組、DH+LY294002組的心肌組織Bad蛋白水平均升高(P＜0.01);與DI/R組相比較，DH組心肌組織Bad蛋白水平降低(P＜0.01)，而DH+LY294002組心肌組織Bad蛋白水平差異無顯著性(P＞0.05);與DH組相比較，DH+LY294002組心肌組織Bad蛋白水平升高(P＜0.01)。與DS組比較，DI/

9、R組、DH組、DH+LY294002組心肌組織pAktmRNA表達(dá)水平均增高(P＜0.01);與DI/R組相比較，DH組心肌組織pAktmRNA表達(dá)水平增高(P＜0.01)，而DH+LY294002組心肌組織Bad蛋白水平差異無顯著性(P＞0.05);與DH組相比較，DH+LY294002組心肌組織pAktmRNA表達(dá)水平降低(P＜0.01)。
　　結(jié)論:氫氣有效抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過激活PI3K