腎素前體及其受體對人臍動脈平滑肌細胞增殖和凋亡的影響及其機制的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化以及由其引發(fā)的心腦血管疾病嚴重危害著人類的健康，關于動脈粥樣硬化的發(fā)生機制，有多種學說包括脂質(zhì)浸潤學說，血栓形成學說，平滑肌細胞克隆學說及炎癥損傷反應學說，目前最為認可的是ROSS提出的炎癥損傷反應學說，他認為在各種刺激因素的作用下，首先動脈內(nèi)膜損傷，內(nèi)皮功能被破壞，繼而分泌各種炎性因子，通過炎性因子的作用，平滑肌細胞表現(xiàn)出異常的多度增殖及凋亡不足，形成動脈粥樣斑塊從而引發(fā)各種心血管疾病。
　　腎素-血管緊張素系統(tǒng)(R

2、enin-AngiotensinSystem，RAS)作為人體的一個重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)人體血壓，水分及電解質(zhì)以保持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。RAS的過度激活可導致多種心血管疾病的發(fā)生，例如高血壓，動脈粥樣硬化，心肌肥厚，心力衰竭等。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ，AngⅡ)是RAS的主要活性物質(zhì)，AngⅡ與其受體結合后可發(fā)揮一系列促進增殖，促纖維化和促炎性反應，繼而導致靶器官的損害，其在平滑肌細胞的增殖遷移及動脈粥樣硬化的形成中

3、發(fā)揮重要作用。
　　腎素前體主要由腎臟分泌，并且在腎臟被激活轉(zhuǎn)換為有活性的腎素。腎素前體本身一直被認為是沒有活性的，但在上世紀80年代有報道顯示在糖尿病患者中血漿腎素前體水平增多，隨后的研究顯示糖尿病患者中腎素前體的增多與微血管并發(fā)癥有關聯(lián)，并且早于微量白蛋白尿的出現(xiàn)，腎素前體水平連同糖化血紅蛋白可以用來預測微量白蛋白尿的出現(xiàn)。這些足以說明腎素前體是具有功能的，提示機體可能處于一種病理狀態(tài)，甚至可以作為預測某些疾病的一個指標。

4、r>　　直到2002年Nguyen等提出有功能的腎素（前體）受體[(pro)reninreceptor，PRR]，并證實了它存在于心臟、大腦、胎盤、腎臟和肝臟，發(fā)現(xiàn)腎素前體可與PRR在納摩爾水平結合，除了通過傳統(tǒng)的AngⅡ途徑發(fā)揮作用，還可以不依賴于AngⅡ的方式發(fā)揮作用，激活信號通路，引起促纖維化促炎癥等一系列反應，導致靶器官的損傷，這使人們對RAS有了新的認識。阻斷RAS系統(tǒng)被認為具有心血管獲益并能減低心血管疾病的風險，但卻并不能完

5、全抑制心血管疾病的發(fā)生，其原因可能存在其他機制導致心血管疾病的發(fā)生，腎素前體及PRR產(chǎn)生的獨立于AngⅡ卻類似于AngⅡ的作用可能為其中的一種機制。我們將以此為基礎，研究腎素前體及PRR在不依賴于AngⅡ的作用下對人臍動脈平滑肌細胞增殖及凋亡蛋白表達的影響。
　　動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展被認為是一種慢性炎癥過程，而炎癥的一個重要標志就是活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的產(chǎn)生。氧化應激是一種ROS過量生成損

6、害了細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的病理狀態(tài)。大量的研究證實，ROS的產(chǎn)生在心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。由炎癥細胞及血管壁上各型細胞產(chǎn)的ROS能引起細胞的增殖、凋亡、遷移及促炎性基因的表達增多，ROS引起的各型細胞的損傷及功能上的變化形成了動脈粥樣硬化的病理基礎。NADPH氧化酶系統(tǒng)是血管壁上ROS的主要來源，AngⅡ能夠激活NADPH氧化酶生成ROS，進一步損傷內(nèi)皮功能，加速降解NO，使內(nèi)皮收縮功能降低，同時促進平滑肌細胞的表型的轉(zhuǎn)換，

7、引起異常的增殖遷移，基質(zhì)蛋白生成增多。對于PRR作用的分子機制尚不完全明確，PRR能否像AngⅡ一樣通過氧化應激引起平滑肌細胞發(fā)生各種促進動脈粥樣硬化形成的改變？我們將以此為研究對象，研究腎素前體及PRR對人臍動脈平滑肌細胞(humanumbilicalarterysmoothmusclecells，HUASMCs)氧化應激的影響。
　　促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK

8、)是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的重要蛋白酶，包括ERK、JNK、p38MAPK及ERK5四個亞族，其中細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK1/2)信號轉(zhuǎn)導通路與細胞的增殖分化密切相關。各種刺激因素通過激活ERK1/2信號通路，使其磷酸化水平增多而發(fā)揮促進增殖作用，促炎性因子的表達等。研究證實AngⅡ可通過氧化應激產(chǎn)生ROS進一步激活ERK1/2信號通路，從而促進平滑肌細胞的增殖。因此，

9、我們將以此為基礎，探討腎素前體及PRR能否通過激活HUASMCs中ERK1/2信號通路進一步影響細胞增殖作用，并探討ERK1/2信號通路及其與氧化應激的關系。
　　目的:
　　觀察PRR在人臍動脈平滑肌細胞中的分布，觀察腎素前體及其受體對HUASMCs增殖的影響及對凋亡蛋白Bcl-2，Bax表達的影響，研究ROS產(chǎn)生和ERK1/2信號通路在其中的作用。
　　方法:
　　1.用免疫熒光法觀察PRR在HUASMCs中

10、的分布。
　　2.在纈沙坦及PD123319阻斷AngⅡ的作用下，分別以濃度為0.1nM，1nM，10nM的腎素前體干預HUASMCs24-48h，用CCK-8檢測細胞的增殖水平。
　　3.在纈沙坦及PD123319阻斷AngⅡ的作用下，分別以濃度為0.1nM，1nM，10nM的腎素前體干預HUASMCs24h，各組用real-timePCR及westernblot方法檢測Bcl-2，Bax蛋白mRNA及蛋白表達水平。

11、>　　4.用siRNAPRR轉(zhuǎn)染HUASMCs24，48及72小時后，用real-timePCR及westernblot方法檢測PRR的mRNA及蛋白表達，確定轉(zhuǎn)染效率最強時間點。
　　5.用siRNA的方法使PRR表達下調(diào)后，再用纈沙坦及PD123319預處理30min后，以濃度為10nM的腎素前體干預HUASMCs24h，分別用CCK-8檢測細胞的增殖水平，用real-timePCR及westernblot方法檢測Bcl-2，

12、Bax蛋白mRNA及蛋白表達水平。
　　6.在纈沙坦及PD123319阻斷AngⅡ的作用下，分別以濃度為0.1nM，1nM，10nM的腎素前體干預HUASMCs24h，然后收集細胞，在流式細胞儀上檢測ROS水平。
　　7.用siRNA的方法使PRR表達下調(diào)后，再用纈沙坦及PD123319預處理30min后，以濃度為10nM的腎素前體干預HUASMCs24h，在流式細胞儀上檢測ROS水平。
　　8.在纈沙坦及PD1233

13、19阻斷AngⅡ的作用下，以濃度為10nM的腎素前體干預HUASMCs0-60min，用westernblot方法檢測ERK1/2磷酸化水平。
　　9.用DPI（NADPH氧化酶抑制劑）預處理HUASMCs30min后，再以濃度為10nM的腎素前體干預HUASMCs，用westernblot方法檢測ERK1/2磷酸化水平。
　　10.分別用PD98059（ERK1/2信號通路阻斷劑）和DPI預處理HUASMCs30min后，

14、再以濃度為10nM的腎素前體干預HUASMCs，用CCK-8檢測細胞的增殖，用real-timePCR及westernblot方法檢測Bcl-2，Bax蛋白mRNA及蛋白表達水平。
　　結果:
　　1.HUASMCs存在PRR的表達，細胞整個胞質(zhì)中均有表達，在細胞核周圍表達更明顯。
　　2.不同濃度腎素前體可在不依賴于AngⅡ的作用下促進HUASMCs的增殖，并且濃度在10nM時最強。
　　3.用10nM濃度的腎

15、素前體干預HUASMCs24-48h，隨著時間延長，增殖作用明顯增強。
　　4.腎素前體可在不依賴于AngⅡ的作用下上調(diào)Bcl-2蛋白的表達，下調(diào)Bax蛋白的表達，抑制凋亡。
　　5.siRNAPRR轉(zhuǎn)染后，能減弱腎素前體引起的HUASMCs增殖作用，并且減弱腎素前體調(diào)節(jié)HUASMCs凋亡蛋白表達的作用。
　　6.腎素前體在不依賴于AngⅡ的作用下，能夠促進HUASMCsROS的生成，并且在腎素前體10nM濃度條件下的

16、促增殖作用最明顯，而siRNAPRR轉(zhuǎn)染后能夠減少腎素前體引起的HUASMCs中ROS的生成。
　　7.腎素前體可在不依賴于AngⅡ的作用下將ERK1/2信號通路激活，并且磷酸化程度在15min-30min時作用最強。
　　8.DPI及PD98059能抑制腎素前體引起的ERK1/2信號通路激活。
　　9.DPI及PD98059可使腎素前體引起的HUASMCs的增殖作用明顯減弱。
　　10.DPI及PD98059可

17、明顯減弱腎素前體引起的HUASMCs的抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA及蛋白表達的上調(diào)作用。
　　11.DPI及PD98059可明顯減弱腎素前體引起的HUASMCs的促凋亡蛋白BaxmRNA及蛋白表達的下調(diào)作用。
　　結論:
　　1.PRR存在于HUASMCs中。
　　2.腎素前體可通過PRR在不依賴于AngⅡ的作用下，促進HUASMCs的增殖，并上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達。