腎素前體及其受體對人臍動脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機制的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化以及由其引發(fā)的心腦血管疾病嚴(yán)重危害著人類的健康，關(guān)于動脈粥樣硬化的發(fā)生機制，有多種學(xué)說包括脂質(zhì)浸潤學(xué)說，血栓形成學(xué)說，平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說及炎癥損傷反應(yīng)學(xué)說，目前最為認(rèn)可的是ROSS提出的炎癥損傷反應(yīng)學(xué)說，他認(rèn)為在各種刺激因素的作用下，首先動脈內(nèi)膜損傷，內(nèi)皮功能被破壞，繼而分泌各種炎性因子，通過炎性因子的作用，平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)出異常的多度增殖及凋亡不足，形成動脈粥樣斑塊從而引發(fā)各種心血管疾病。
　　腎素-血管緊張素系統(tǒng)(R

2、enin-AngiotensinSystem，RAS)作為人體的一個重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)人體血壓，水分及電解質(zhì)以保持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。RAS的過度激活可導(dǎo)致多種心血管疾病的發(fā)生，例如高血壓，動脈粥樣硬化，心肌肥厚，心力衰竭等。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ，AngⅡ)是RAS的主要活性物質(zhì)，AngⅡ與其受體結(jié)合后可發(fā)揮一系列促進增殖，促纖維化和促炎性反應(yīng)，繼而導(dǎo)致靶器官的損害，其在平滑肌細(xì)胞的增殖遷移及動脈粥樣硬化的形成中

3、發(fā)揮重要作用。
　　腎素前體主要由腎臟分泌，并且在腎臟被激活轉(zhuǎn)換為有活性的腎素。腎素前體本身一直被認(rèn)為是沒有活性的，但在上世紀(jì)80年代有報道顯示在糖尿病患者中血漿腎素前體水平增多，隨后的研究顯示糖尿病患者中腎素前體的增多與微血管并發(fā)癥有關(guān)聯(lián)，并且早于微量白蛋白尿的出現(xiàn)，腎素前體水平連同糖化血紅蛋白可以用來預(yù)測微量白蛋白尿的出現(xiàn)。這些足以說明腎素前體是具有功能的，提示機體可能處于一種病理狀態(tài)，甚至可以作為預(yù)測某些疾病的一個指標(biāo)。

4、r>　　直到2002年Nguyen等提出有功能的腎素（前體）受體[(pro)reninreceptor，PRR]，并證實了它存在于心臟、大腦、胎盤、腎臟和肝臟，發(fā)現(xiàn)腎素前體可與PRR在納摩爾水平結(jié)合，除了通過傳統(tǒng)的AngⅡ途徑發(fā)揮作用，還可以不依賴于AngⅡ的方式發(fā)揮作用，激活信號通路，引起促纖維化促炎癥等一系列反應(yīng)，導(dǎo)致靶器官的損傷，這使人們對RAS有了新的認(rèn)識。阻斷RAS系統(tǒng)被認(rèn)為具有心血管獲益并能減低心血管疾病的風(fēng)險，但卻并不能完

5、全抑制心血管疾病的發(fā)生，其原因可能存在其他機制導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生，腎素前體及PRR產(chǎn)生的獨立于AngⅡ卻類似于AngⅡ的作用可能為其中的一種機制。我們將以此為基礎(chǔ)，研究腎素前體及PRR在不依賴于AngⅡ的作用下對人臍動脈平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡蛋白表達(dá)的影響。
　　動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展被認(rèn)為是一種慢性炎癥過程，而炎癥的一個重要標(biāo)志就是活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的產(chǎn)生。氧化應(yīng)激是一種ROS過量生成損

6、害了細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的病理狀態(tài)。大量的研究證實，ROS的產(chǎn)生在心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。由炎癥細(xì)胞及血管壁上各型細(xì)胞產(chǎn)的ROS能引起細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及促炎性基因的表達(dá)增多，ROS引起的各型細(xì)胞的損傷及功能上的變化形成了動脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)。NADPH氧化酶系統(tǒng)是血管壁上ROS的主要來源，AngⅡ能夠激活NADPH氧化酶生成ROS，進一步損傷內(nèi)皮功能，加速降解NO，使內(nèi)皮收縮功能降低，同時促進平滑肌細(xì)胞的表型的轉(zhuǎn)換，

7、引起異常的增殖遷移，基質(zhì)蛋白生成增多。對于PRR作用的分子機制尚不完全明確，PRR能否像AngⅡ一樣通過氧化應(yīng)激引起平滑肌細(xì)胞發(fā)生各種促進動脈粥樣硬化形成的改變？我們將以此為研究對象，研究腎素前體及PRR對人臍動脈平滑肌細(xì)胞(humanumbilicalarterysmoothmusclecells，HUASMCs)氧化應(yīng)激的影響。
　　促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK

8、)是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要蛋白酶，包括ERK、JNK、p38MAPK及ERK5四個亞族，其中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK1/2)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)。各種刺激因素通過激活ERK1/2信號通路，使其磷酸化水平增多而發(fā)揮促進增殖作用，促炎性因子的表達(dá)等。研究證實AngⅡ可通過氧化應(yīng)激產(chǎn)生ROS進一步激活ERK1/2信號通路，從而促進平滑肌細(xì)胞的增殖。因此，

9、我們將以此為基礎(chǔ)，探討腎素前體及PRR能否通過激活HUASMCs中ERK1/2信號通路進一步影響細(xì)胞增殖作用，并探討ERK1/2信號通路及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系。
　　目的:
　　觀察PRR在人臍動脈平滑肌細(xì)胞中的分布，觀察腎素前體及其受體對HUASMCs增殖的影響及對凋亡蛋白Bcl-2，Bax表達(dá)的影響，研究ROS產(chǎn)生和ERK1/2信號通路在其中的作用。
　　方法:
　　1.用免疫熒光法觀察PRR在HUASMCs中

10、的分布。
　　2.在纈沙坦及PD123319阻斷AngⅡ的作用下，分別以濃度為0.1nM，1nM，10nM的腎素前體干預(yù)HUASMCs24-48h，用CCK-8檢測細(xì)胞的增殖水平。
　　3.在纈沙坦及PD123319阻斷AngⅡ的作用下，分別以濃度為0.1nM，1nM，10nM的腎素前體干預(yù)HUASMCs24h，各組用real-timePCR及westernblot方法檢測Bcl-2，Bax蛋白mRNA及蛋白表達(dá)水平。

11、>　　4.用siRNAPRR轉(zhuǎn)染HUASMCs24，48及72小時后，用real-timePCR及westernblot方法檢測PRR的mRNA及蛋白表達(dá)，確定轉(zhuǎn)染效率最強時間點。
　　5.用siRNA的方法使PRR表達(dá)下調(diào)后，再用纈沙坦及PD123319預(yù)處理30min后，以濃度為10nM的腎素前體干預(yù)HUASMCs24h，分別用CCK-8檢測細(xì)胞的增殖水平，用real-timePCR及westernblot方法檢測Bcl-2，

12、Bax蛋白mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　6.在纈沙坦及PD123319阻斷AngⅡ的作用下，分別以濃度為0.1nM，1nM，10nM的腎素前體干預(yù)HUASMCs24h，然后收集細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上檢測ROS水平。
　　7.用siRNA的方法使PRR表達(dá)下調(diào)后，再用纈沙坦及PD123319預(yù)處理30min后，以濃度為10nM的腎素前體干預(yù)HUASMCs24h，在流式細(xì)胞儀上檢測ROS水平。
　　8.在纈沙坦及PD1233

13、19阻斷AngⅡ的作用下，以濃度為10nM的腎素前體干預(yù)HUASMCs0-60min，用westernblot方法檢測ERK1/2磷酸化水平。
　　9.用DPI（NADPH氧化酶抑制劑）預(yù)處理HUASMCs30min后，再以濃度為10nM的腎素前體干預(yù)HUASMCs，用westernblot方法檢測ERK1/2磷酸化水平。
　　10.分別用PD98059（ERK1/2信號通路阻斷劑）和DPI預(yù)處理HUASMCs30min后，

14、再以濃度為10nM的腎素前體干預(yù)HUASMCs，用CCK-8檢測細(xì)胞的增殖，用real-timePCR及westernblot方法檢測Bcl-2，Bax蛋白mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.HUASMCs存在PRR的表達(dá)，細(xì)胞整個胞質(zhì)中均有表達(dá)，在細(xì)胞核周圍表達(dá)更明顯。
　　2.不同濃度腎素前體可在不依賴于AngⅡ的作用下促進HUASMCs的增殖，并且濃度在10nM時最強。
　　3.用10nM濃度的腎

15、素前體干預(yù)HUASMCs24-48h，隨著時間延長，增殖作用明顯增強。
　　4.腎素前體可在不依賴于AngⅡ的作用下上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，抑制凋亡。
　　5.siRNAPRR轉(zhuǎn)染后，能減弱腎素前體引起的HUASMCs增殖作用，并且減弱腎素前體調(diào)節(jié)HUASMCs凋亡蛋白表達(dá)的作用。
　　6.腎素前體在不依賴于AngⅡ的作用下，能夠促進HUASMCsROS的生成，并且在腎素前體10nM濃度條件下的

16、促增殖作用最明顯，而siRNAPRR轉(zhuǎn)染后能夠減少腎素前體引起的HUASMCs中ROS的生成。
　　7.腎素前體可在不依賴于AngⅡ的作用下將ERK1/2信號通路激活，并且磷酸化程度在15min-30min時作用最強。
　　8.DPI及PD98059能抑制腎素前體引起的ERK1/2信號通路激活。
　　9.DPI及PD98059可使腎素前體引起的HUASMCs的增殖作用明顯減弱。
　　10.DPI及PD98059可

17、明顯減弱腎素前體引起的HUASMCs的抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。
　　11.DPI及PD98059可明顯減弱腎素前體引起的HUASMCs的促凋亡蛋白BaxmRNA及蛋白表達(dá)的下調(diào)作用。
　　結(jié)論:
　　1.PRR存在于HUASMCs中。
　　2.腎素前體可通過PRR在不依賴于AngⅡ的作用下，促進HUASMCs的增殖，并上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。