血管緊張素-(1-7)對(duì)人臍靜脈平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及其可能機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)在成功復(fù)制出人臍靜脈平滑肌細(xì)胞(human umbilical vein smooth muscle cells，HUSMCs)鈣化模型的基礎(chǔ)上，觀察血管緊張素-(1-7)[Angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)]對(duì)HUSMCs鈣沉積的影響，探索Ang-(1-7)延緩或抑制HUSMCs鈣沉積的可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.HUSMCs鈣化模型的復(fù)制
　　 采用不同

2、濃度β-甘油磷酸鹽（β-GP）刺激體外培養(yǎng)的HUSMCs，分為5組（n=6）：對(duì)照組（CON），終濃度為10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L、16mmol/L的β-甘油磷酸鹽組（即10mmol/L組、12mmol/L組、14mmol/L組、16mmol/L組）。采用Von Kossa染色觀察HUSMCs鈣沉積情況，顯微圖像分析Von Kossa染色鈣化細(xì)胞百分比，磷酸苯二鈉法測(cè)定細(xì)胞中堿性磷酸酶（ALP）活性，甲基百里香

3、酚藍(lán)法測(cè)定各組細(xì)胞中鈣含量，探尋β-GP復(fù)制HUSMCs鈣化模型的最佳濃度。
　　 2.血管緊張素-（1-7）對(duì)HUSMCs鈣化的影響
　　 2.1.在成功復(fù)制HUSMCs鈣化模型基礎(chǔ)上，給予血管緊張素-（1-7）進(jìn)行干預(yù)，分為6組（n=6）：對(duì)照組（CON）、鈣化組（CAL）、單純血管緊張素-（1-7）組[Ang-(1-7)組]、鈣化+血管緊張素-（1-7)高劑量組[Ang-(1-7) H組]、鈣化+血管緊張素-（1-

4、7)中劑量組[Ang-(1-7)M組]、鈣化+血管緊張素-（1-7)低劑量組[Ang-(1-7) L組]。
　　 2.2.檢測(cè)方法
　　 ①對(duì)細(xì)胞Von Kossa染色、顯微圖像分析、ALP活性和細(xì)胞鈣含量等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，觀察各組細(xì)胞鈣沉積情況。
　　 ②酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中TGFβ1活性。
　　 ③Western blot法檢測(cè)HUSMCs中核心結(jié)合因子1（core binding facto

5、r α1，Cbfα1）蛋白表達(dá)。
　　 ④放射免疫技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液中骨鈣素（OC）含量，觀察HUSMCs骨鈣素變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.HUSMCs鈣化模型復(fù)制
　　 不同濃度β-GP誘導(dǎo)體外HUSMCs鈣化，Von Kossa染色結(jié)果顯示12mmol/L組大量HUSMCs呈菊花狀聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞聚集處可見(jiàn)棕褐色鈣結(jié)節(jié)，顯微圖像分析系統(tǒng)定量計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)12mmol/L組與CON組、10mmol/L組、1

6、4mmol/L組、16mmol/L組相比，鈣化細(xì)胞百分比明顯增加，細(xì)胞鈣含量和ALP活性均顯著升高，有顯著性差異。
　　 2.血管緊張素-（1-7）對(duì)HUSMCs鈣化影響
　　 ①Ang-(1-7)可明顯減少HUSMCs聚集生長(zhǎng)，Von Kossa染色顯示細(xì)胞聚集處棕褐色鈣結(jié)節(jié)較CAL組明顯減輕（P<0.01)，Ang-(1-7)高、中、低劑量組鈣化細(xì)胞百分比、細(xì)胞鈣含量和ALP活性較CAL組明顯降低（均為P<0.01)

7、。
　　 ②Ang-(1-7)高、中、低劑量組與CAL組相比細(xì)胞TGFβ1水平、cbfα1表達(dá)、骨鈣素含量均降低（分別P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1．12mmol/L β-GP刺激HUSMCs10天，可成功復(fù)制體外HUSMCs鈣沉積模型。
　　 2．采用顯微圖像分析系統(tǒng)可定量計(jì)算出Von Kossa染色鈣沉積情況，可作為鑒定Von Kossa染色鈣化的輔助方法。。
　　 3、Ang-(1