Visfatin對大鼠腎系膜細胞增殖及腎素-血管緊張素系統(tǒng)表達的影響.pdf

1、研究背景:
　　 糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致殘、致死的主要原因。DN的確切發(fā)病機制不明，目前認為受多方面因素的影響，包括代謝因素、血流動力學(xué)因素、氧化應(yīng)激、遺傳因素等。近年來慢性低度炎癥及固有免疫系統(tǒng)的激活在DN的發(fā)病中受到越來越多的重視，多種炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-18等通過自分泌和旁分泌方式導(dǎo)致炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)而參與DN

2、發(fā)病。有學(xué)者提出把糖尿病腎臟疾病看作一種由代謝紊亂引起的炎癥性疾病。
　　 內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)是新近識別的一種脂肪細胞因子，具有促進炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)功能，在多種不同細胞中Visfatin激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及促進炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6等的表達，參與了一大類急慢性炎癥相關(guān)疾病如急性肺損傷、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化等的發(fā)病。在2型糖尿病病人中，血漿Visf

3、atin濃度升高、是2型糖尿病的獨立相關(guān)因素，并且與肌酐清除率呈負相關(guān)、與尿白蛋白排泄率呈正相關(guān)。Cha研究小組的結(jié)果更是顯示遺傳性2型糖尿病大鼠腎小球及腎間質(zhì)Visfatin水平均比對照組大鼠升高；這些大鼠在DN早期時血漿Visfatin濃度就明顯升高，并與微量白蛋白尿呈正相關(guān)；大鼠腎小球系膜細胞、足細胞、近端腎小管細胞均表達并分泌Visfatin，而Visfatin能進一步促進上述三種腎臟固有細胞表達促纖維化分子及細胞外基質(zhì)，提示炎

4、癥因子Visfatin也在DN的發(fā)病中起一定的作用。而Visfatin以何種機制參與DN的發(fā)病?尚待研究。
　　 大量研究表明，腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的過度激活是DN發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。RAS的主要效應(yīng)分子血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)除了血流動力學(xué)調(diào)節(jié)作用之外，還作為促生長、促纖維化及促炎因子導(dǎo)致腎臟功能損害，其中AngⅡ與NF-κB的相互激活介導(dǎo)

5、的級聯(lián)炎癥反應(yīng)起了關(guān)鍵作用。如前述，有研究顯示Visfatin可激活NF-κB，而NF-κB又可激活A(yù)ngⅡ，如此推斷，Visfatin是否通過激活RAS通路而參與DN發(fā)病呢?系膜細胞是腎小球中功能最活躍的一類細胞，在病理狀態(tài)下大量增殖，分泌炎癥因子，并合成大量細胞外基質(zhì)，促進腎臟病變進展。Visfatin參與DN發(fā)病，是否也對系膜細胞有直接促增殖作用呢?本課題以大鼠腎系膜細胞為模型，研究Visfatin對系膜細胞增殖及RAS表達的直接

6、調(diào)節(jié)作用，以期從細胞增殖方面研究Visfatin對DN的致病作用及闡明局部RAS激活在Visfatin參與DN發(fā)病中的可能作用。
　　 研究目的:
　　 1.觀察Visfatin對大鼠腎系膜細胞增殖的影響。
　　 2.觀察Visfatin對大鼠腎系膜細胞RAS主要成員：腎素、血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE

7、)、AngⅡ、血管緊張素Ⅱ受體1(AngⅡ type1 receptor，AT1)和血管緊張素Ⅱ受體2(AngⅡ type2 receptor，AT2)的直接調(diào)節(jié)作用。
　　 研究方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 在37℃、5％CO2環(huán)境中，用含10％胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1，當(dāng)細胞長至70％-80％融合時，改用含1％FCS的低糖

8、DMEM同步化過夜。
　　 2.重組大鼠Visfatin干預(yù)實驗
　　 不同終濃度(0、1、10、100、200ng/ml)Visfatin干預(yù)系膜細胞24h及100ng/mlVisfatin干預(yù)細胞不同時長(0、12、24、48h)，觀察Visfatin對系膜細胞增殖影響的濃度效應(yīng)及時間效應(yīng)。
　　 不同終濃度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin干預(yù)系膜細胞48h，觀察Visfatin對系膜細胞R

9、AS主要成員mRNA及蛋白表達影響的濃度效應(yīng)。
　　 不同終濃度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin干預(yù)系膜細胞48h及100ng/mlVisfatin干預(yù)細胞不同時長(0、12、24、48h)，觀察Visfatin對系膜細胞培養(yǎng)上清液AngⅡ生成影響的濃度效應(yīng)及時間效應(yīng)。
　　 3.CCK-8試劑盒WST-8法檢測系膜細胞增殖。
　　 4.Real time-PCR檢測系膜細胞腎素、AGT、ACE

10、、AT1、AT2 mRNA表達。
　　 5.Western Blot檢測系膜細胞AGT、AT1蛋白表達。
　　 6.放射免疫法檢測培養(yǎng)上清液中AngⅡ活性。
　　 7.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組正態(tài)分布的數(shù)據(jù)或經(jīng)轉(zhuǎn)換后呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，多組間兩兩比較采用最小有意義差異(least signifi

11、cant difference，LSD)t檢驗。顯著性水準(zhǔn)為P＜0.05。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.Visfatin對系膜細胞增殖的影響
　　 系膜細胞與不同濃度(0、1、10、100、200ng/ml)Visfatin孵育24h，隨著Visfatin濃度增高，細胞增殖逐漸增多，呈劑量依賴性，Visfatin濃度自10ng/ml起，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 系膜細胞與100ng/ml V

12、isfatin孵育不同時長(0、12、24、48h)，隨著孵育時間延長，細胞增殖逐漸增多，呈時間依賴性。孵育時間自12h起，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；孵育時間為24h時，細胞增殖達到頂峰；延長孵育時間至48h細胞增殖不再繼續(xù)增加。
　　 2.Visfatin對系膜細胞腎素、AGT、ACE、AT1、AT2 mRNA表達的影響
　　 系膜細胞與不同濃度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin孵育48h，隨著V

13、isfatin濃度增高，腎素、AGT、AT1 mRNA相對表達量逐漸升高，呈劑量依賴性，Visfatin濃度自10ng/ml起，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而ACE、AT2 mRNA相對表達量在Visfatin刺激前后保持不變。
　　 3.Visfatin對系膜細胞AGT、AT1蛋白表達的影響
　　 系膜細胞與不同濃度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin孵育48h，隨著Visfatin濃度增高，AGT蛋

14、白表達逐漸升高，呈劑量依賴性，Visfatin濃度自10ng/ml起，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；AT1蛋白表達在Visfatin濃度為100ng/ml時與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.Visfatin對系膜細胞培養(yǎng)上清液AngⅡ生成的影響
　　 系膜細胞與不同濃度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin孵育48h，隨著Visfatin濃度增高，細胞上清液AngⅡ含量逐漸增多，呈劑量依賴性，Vi

15、sfatin濃度自1ng/ml起，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 系膜細胞與100ng/ml Visfatin孵育不同時長(0、12、24、48h)，隨著孵育時間延長，細胞上清液AngⅡ含量逐漸增多，呈時間依賴性。孵育時間自12h起，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；孵育時間為24h時，AngⅡ含量達到頂峰；延長孵育時間至48hAngⅡ含量不再繼續(xù)增多。
　　 結(jié)論:
　　 1.Visfatin以時間及劑量

16、依賴方式促進系膜細胞增殖。
　　 2.大鼠腎小球系膜細胞表達腎素、AGT、ACE、AT1及AT2。
　　 3.Visfatin以劑量依賴方式促進系膜細胞AGT mRNA及蛋白表達，以時間及劑量依賴方式促進系膜細胞AngⅡ生成。
　　 4.Visfatin促進系膜細胞腎素mRNA表達，而對ACE mRNA表達無影響。
　　 5.Visfatin促進系膜細胞AT1 mRNA及蛋白表達，而對AT2 mRNA表達