阻斷腎素血管緊張素系統(tǒng)對胰島β細胞功能的效應及機制研究.pdf

1、目的：
　　 近年來腎素血管緊張素系統(tǒng)與2型糖尿病的關系日益得到關注，RAS在胰島β細胞功能障礙發(fā)生中的作用及其干預價值成為2型糖尿病防治研究的熱點之一。本課題通過長期高脂高熱量飲食構建胰島素抵抗大鼠模型，以高脂飲食加小劑量鏈尿佐菌素腹腔注射構建糖尿病大鼠模型，觀察在糖尿病發(fā)病的不同階段阻斷RAS對胰島β細胞功能的保護效應及機制，及其對STZ致糖尿病發(fā)生率的影響，并通過體外對β細胞系INS-1細胞的培養(yǎng)及處理，探討RAS活化參與

2、β細胞功能損害的分子機制。
　　 方法：
　　 (1)阻斷RAS對胰島素抵抗大鼠胰島β細胞功能的效應及機制，及其對STZ致糖尿病發(fā)生率的影響：90只8周齡雄性Wistar 大鼠，隨機分為正常對照組和胰島素抵抗造模組。胰島素抵抗造模組給予高脂高熱量飲食喂養(yǎng)16周，隨機分為高脂對照組，培哚普利干預組，替米沙坦干預組，共干預8 周。為了觀察在胰島素抵抗階段阻斷RAS對STZ致糖尿病發(fā)生率的影響，分別從高脂對照組及替米沙坦干預組

3、中隨機選擇15只大鼠作為高脂+小劑量STZ 腹腔注射組及替米沙坦干預+小劑量STZ腹腔注射組，禁食10-12h，以20mg/kg的劑量腹腔注射STZ，1周后以非同日2次隨機血糖≥16.7mmol/l者為糖尿病大鼠，繼續(xù)喂養(yǎng)周。
　　 (2)阻斷RAS對糖尿病大鼠胰島β細胞功能的效應及機制研究：50只8周齡雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組和糖尿病造模組。糖尿病組以高脂高熱量飲食喂養(yǎng)8周后予小劑量ST腹腔注射誘導糖尿病，納入標

4、準同上，隨機分為糖尿病組、ACEI干預組、ARB干預組，共干預8周。
　　 (3)RAS參與β細胞功能損害的相關分子機制研究：體外培養(yǎng)β細胞系INS-1細胞，分別用不同濃度葡萄糖處理不同時間，觀察其對INS-1細胞血管緊張素Ⅱ受體1表達的影響；用不同濃度的Ang Ⅱ處理24h，觀察其對INS-1細胞凋亡、功能以及胰島素信號分子的影響。動物研究中胰島結構、β細胞內胰島素含量、胰島細胞凋亡、炎癥、氧化應激、胰島微血管密度及RAS表達

5、采用免疫組化或反轉錄聚合酶鏈反應法檢測，胰島功能采用靜脈葡萄糖耐量試驗與靜脈胰島素釋放試驗檢測，胰島素敏感性采用高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗檢測；體外研究中INS-1細胞AT1 R及胰島素基因表達采用RT-PCR檢測，細胞活性、凋亡及胰島素信號分子分別采用MTT法、免疫熒光與流式細胞儀及western-blot法檢測。
　　 結果：
　　 1. 胰島素抵抗階段阻斷RAS對胰島β細胞功能的效應及機制，及其對STZ 致糖尿病發(fā)生

6、率的影響
　　 1.1 長期高脂高熱量飲食喂養(yǎng)大鼠胰島素敏感性及胰島β細胞功能
　　 與正常對照組相比，高脂對照組穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注率顯著降低，說明FC組出現(xiàn)了明顯的胰島素抵抗；FC組胰島增生肥大，胰島內胰島素相對含量較NC組顯著降低，提示FC組大鼠β細胞內胰島素儲備不足；胰島素陽性細胞核密度也有減少趨勢，但是差異無統(tǒng)計學意義；葡萄糖負荷后第一時相胰島素分泌高峰延遲，0-10min 胰島素曲線下面積低于NC組，但是10-60

7、minAUCI超過NC組68.8%，提示FC組大鼠胰島素第一時相分泌不足，而出現(xiàn)第二時相異常高分泌。
　　 1.2 胰島素抵抗大鼠胰島內RAS表達、炎癥反應及細胞凋亡
　　 與NC組比較，F(xiàn)C組AT1 R mRNA相對表達量增加了1.16倍，白細胞介素1β相對表達量增加了1.95倍，核因子κB相對濃度增加了20.5%，胰島內凋亡信號分子Caspase-3 相對表達量增加了19.1%，單位胰島面積TUNEL 陽性細胞數(shù)增加

8、了2.43倍。
　　 1.3 阻斷RAS對胰島素抵抗大鼠胰島β細胞功能的影響
　　 藥物干預后，培哚普利干預組、替米沙坦干預組IRC較FC組明顯增加，分別為（-4.99±0.12）與（-4.87±0.09）；ICD也有所增加，但是差異無統(tǒng)計學意義；AUCI分別下降了15.6%、17.3%，AUCI及AUCI也有所下降，但差異無顯著性。說明阻斷RAS具有增加胰島素抵抗大鼠β細胞內胰島素含量及部分改善胰島素分泌模型的的效應。

9、FP組、FT組之間差異均無顯著性。
　　 1.4 阻斷RAS對胰島素抵抗大鼠胰島內炎癥及細胞凋亡的效應
　　 與FC組相比，F(xiàn)P組、FT組胰島內AT1 R mRNA相對表達量明顯降低，IL-1 β相對表達量降低了22.4%、28.5%；NF-KB相對含量分別下降了20.1%、22.8%（均P<0.01）；Caspase-3相對表達量分別降低了15.5%、17.7%；單位胰島面積TUNEL 陽性細胞數(shù)分別下降了60.0%及

10、67.4%.說明阻斷RAS可以顯著降低胰島素抵抗大鼠胰島內炎癥反應及細胞凋亡水平。FP組、FT組之間差異均無顯著性。
　　 1.5 在胰島素抵抗階段阻斷RAS對STZ致糖尿病發(fā)生率的影響
　　 與高脂+STZ腹腔注射組比較，替米沙坦干預+ST腹腔注射組糖尿病的發(fā)生率顯著降低，分別為80.0%、33.3%。兩組平均空腹血糖也有顯著差異。
　　 2. 糖尿病階段阻斷RAS對胰島β細胞功能的效應及機制
　　 2

11、.1 高脂飲食加小劑量STZ 腹腔注射構建的糖尿病大鼠模型胰島結構與功能
　　 與正常對照組相比，糖尿病組大鼠胰島形態(tài)不規(guī)則，邊界模糊，結構紊亂，IRC顯著下降；胰島素第一時相分泌高峰延遲、峰值降低，AUCI下降了67.0%，早期胰島素分泌指數(shù)降低了81.1％
　　 2.2 糖尿病大鼠胰島內RAS表達、氧化應激、微血管密度及細胞凋亡
　　 與NC組比較，DM組胰島內血管緊張素原mRNA表達顯著增加；誘導型一氧化氮

12、合酶相對濃度增加了10.3%，提示糖尿病狀態(tài)下胰島局部氧化應激反應增強；胰島微血管密度降低了71.4%，低氧誘導因子1αmRNA相對表達量增加了1.19倍，提示糖尿病大鼠胰島處于相對或絕對乏氧狀態(tài)；單位面積胰島細胞凋亡數(shù)增加了2.14倍。
　　 2.3 阻斷RAS對糖尿病大鼠胰島β細胞功能的影響
　　 藥物干預后，ACEI組、ARB組胰島結構有所改善，IRC較DM組明顯增加，AUCI分別增加了41.2%和33.1%，EI

13、SI分別增加了1.84倍和1.74倍，說明阻斷RAS后糖尿病大鼠胰島素第一時相分泌有所恢復。AE組、AR組之間差異均無顯著性。
　　 2.4 阻斷RAS對糖尿病大鼠胰島氧化應激、微血管密度及細胞凋亡的影響
　　 AE組和AR組胰島內iNOS含量較DM組分別下降了16.5%、18.2%；MVD分別增加了62.5%與75.0%，HIF-1α基因表達分別下降了27.2%與29.0%；單位面積胰島凋亡細胞數(shù)分別下降了29.0%、

14、36.2%。AE組、AR組之間差異均無顯著性。
　　 3. RAS參與β細胞功能損害的相關分子機制
　　 3.1不同糖濃度處理不同時間INS-1細胞AT1R基因表達變化
　　 以5.6 mmol/l的葡萄糖培養(yǎng)24h作為基礎對照組，5.6mG培養(yǎng)48h AT1R mRNA表達無明顯改變；16.7mG培養(yǎng)24h后AT1 R mRNA表達增多，但差異無統(tǒng)計學意義，培養(yǎng)48h后AT1 R mRNA表達較對照組增加了0.

15、72倍；33.3mG培養(yǎng)24h，AT1 R表達水平較對照組增加了1.33倍，培養(yǎng)48h后，AT1 R mRNA表達水平進一步增加，為對照組的2.6倍。
　　 3.2不同濃度Ang Ⅱ處理24h對INS-1細胞胰島素分泌功能的影響
　　 以5.6mG 培養(yǎng)24h作為對照組，不同濃度Ang Ⅱ處理組基礎狀態(tài)下的胰島素分泌無明顯改變，但葡萄糖刺激后胰島素分泌分別較對照組下降了7.9%、21.1%、26.3%和34.2%。

16、>　　 3.3不同濃度Ang Ⅱ處理24h對INS-1細胞凋亡的影響
　　 分組同上，觀察INS-1細胞的凋亡率變化。5.6mG培養(yǎng)48h，細胞凋亡率為5.7%，0.1 nmol/l Ang Ⅱ培養(yǎng)24h組細胞凋亡率為10.3%，較對照組增加，但是差異無統(tǒng)計學意義，其余各組隨 Ang Ⅱ濃度增加，細胞凋亡率均顯著增加。
　　 3.4不同濃度Ang Ⅱ處理24h對INS-1細胞胰島素信號分子的影響
　　 以5.6

17、mG培養(yǎng)24h 為對照組，未檢測到磷酸化的胰島素受體底物絲氨酸270位點的表達，而加入不同濃度Ang Ⅱ培養(yǎng)24h后，可檢測到磷酸化IRS-ser270蛋白表達，其相對表達量分別為0.31，0.72；0.1nmol/l Ang Ⅱ處理24h后，蛋白激酶B絲氨酸473位點磷酸化水平較對照組下降了20.1%，100nmol/l Ang Ⅱ培養(yǎng)24后，PKB-ser473磷酸化水平進一步降低，較對照組下降了30.2%。
　　 結論：<

18、br>　　 RAS活化與糖尿病發(fā)病進程中胰島β細胞功能損害密切相關，葡萄糖具有濃度及時間依賴性地上調胰島RAS活性的效應。RAS活化可能通過誘發(fā)胰島炎癥反應、氧化應激、局部血流動力學異常、胰島素受體后信號通路損害及細胞凋亡等機制損傷β
　　 細胞存活與功能。早期阻斷RAS 具有保護胰島β細胞功能的作用，可以顯著降低胰島素抵抗大鼠STZ 致糖尿病的發(fā)生率；在糖尿病階段阻斷RAS，對胰島β細胞存活與功能仍然具有明顯的保護效應。阻斷